史清照，柴國璧，汪軍霞，劉俊輝，范 武，毛 健，席 輝，宋瑜冰，馬 驥，王 予，陶 紅，周 瑢，歐陽路斯，屈 展，宗永立，張建勛，張啟東*，賴燕華*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)香料基礎研究重點實驗室，鄭州高新技術產業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2. 廣東中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，廣州市天河區(qū)林和西橫路186 號 510385

卷煙產品香味物質的剖析始終是煙草領域的研究熱點之一。由于氣相色譜相關技術的發(fā)展，對低分子量、揮發(fā)性強的物質有優(yōu)越的分離能力且配備完備的化合物標準譜庫，卷煙香氣成分分析研究較為豐富[1-4]。相比之下，因揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性弱、需要進行品嘗等不利因素，大大限制了對味覺成分的研究[5-8]。

但與嗅覺相比，味覺分類簡單明確，僅包括酸、甜、苦、咸、鮮5 個指標，適合于以感官為導向的方法進行分析，在食品行業(yè)，也常使用以感官導向為基礎的分離技術分析味覺成分[9-11]。例如，針對豪達奶酪（Gouda cheese），利用凝膠色譜分離奶酪水提物，結合味覺稀釋分析技術（Taste dilution analysis, TDA），從中定位出具有明顯苦、酸、咸、鮮的味覺特征組分，進而分析得到豪達奶酪中苦味特征組分的16 種苦味肽，為該產品苦味特征的分析和調控提供了技術支持[12]。另有研究者以可可粉為研究對象，以感官導向分析法獲得了可可粉中澀感、殘留感、苦味、酸味等化學感覺和味覺特征組分[13]。針對牛肉湯的感官導向分離，獲得了苦味、鮮味、咸味、甜味、酸味和具有強酸味及帶來口干感的味覺特征組分，進而發(fā)現了一種影響牛肉湯總體口味質量，尤其是甜味和鮮味特點的味覺增強劑[14]。

酸味是5 個基本味覺指標之一，也是中式卷煙重要的風格特征，研究發(fā)現，適宜的酸味有助于增強煙氣成熟感，提升煙氣柔和圓潤感[15-16]。目前針對卷煙主流煙氣中酸味成分系統分析的報道較少，大部分研究針對煙氣中總體有機酸，或根據揮發(fā)性將有機酸進行簡單分類，并未對其感官貢獻從嗅覺與味覺兩種角度加以區(qū)分[17-19]，且相關報道所涉及的研究對象并未經過明確篩選與定位，大部分研究對象是飽和脂肪酸。而研究表明，當脂肪酸的碳原子數大于6 時，其味覺特征主要表現為脂肪味、油脂味，酸味較弱[20]。

基于以上背景，借鑒感官導向分析方法，對卷煙主流煙氣粒相物進行凝膠色譜分離，定位主流煙氣粒相物中酸味特征組分，并采用GC/MS 技術定性分析，剖析卷煙煙氣中具有酸味特征的成分，結合測定的閾值獲得酸味成分的味覺活性值（Taste activity value，TAV），評價其酸味貢獻強度，并通過卷煙注射加香及評吸進一步證明特征成分對煙氣的酸味貢獻。通過對酸味成分的系統研究，旨在為卷煙產品酸味感官特征評價提供依據，也為卷煙產品風格的定向設計和相關質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草添加劑安全性評估參比卷煙（上海煙草集團有限責任公司）；實驗用卷煙樣品為12 個市售品牌成品卷煙，包括8 種常規(guī)烤煙型卷煙、3 種低焦油烤煙型卷煙及1 種混合型卷煙。

乙醇（色譜純，北京迪科馬科技有限公司）；超純水（10 MΩ，屈臣氏公司）；己酸（98%）、乳酸（98%）、3-甲基-2-羥基丁酸（99%）、4-甲基-2-羥基戊酸（99%）、蘋果酸（99%）（美國Sigma-Aldrich 公司）；2-羥基丁酸（95%）、3-羥基丙酸（30%）、2,3-二羥基丙酸（20%）、反式-3-己烯酸（99%）（日本Tokyo Chemical Industry 公司）；丙酮（色譜純）、吡啶（色譜純）、2-甲基丁酸（98%）、4-戊烯酸（98%）、羥基乙酸（99%）、亞甲基丁二酸（99%）（J&K Scientific 公司）；乙酰丙酸（98%，美國Alfa-Aesar 公司）；丁二酸、丁二烯酸（99%，美國Acros Organics 公司）；N，O-雙（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSTFA，＞99%，美國Regis Technologies公司）。

7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5MS 色譜柱（60 m×0.25 mm i.d. ×0.25 μm d.f.）（美國Agilent公司）；NGC Quest 10 Plus 型中高壓層析系統（美國Bio-Rad 公司）；凝膠色譜柱（2.6 cm×100 cm）（瑞士Büchi 公司）；Sephadex LH-20填料（瑞典GE Healthcare公司）；SM450 20 孔道直線型吸煙機（英國Cerulean公司mm劍橋濾片（英國Whatman公司）；AL204分析天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；HY-5型振蕩器（金壇中大儀器廠）；R-210 旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Büchi 公司）；Alpha 1-2 LDplus 冷凍干燥機（德國Christ 公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙氣粒相物酸味特征組分的分離

依據參考文獻[4]中的方法，獲得主流煙氣粒相物的水溶性組分。凝膠滲透色譜（GPC）分離該水溶性組分。分離條件為：流動相為蒸餾水，填料為Sephadex LH-20，流速1 mL/min，通過收集器每10 min收集一個流份，共收集40 個流份。紫外檢測儀監(jiān)測以確定收集流份的起點和終點。參考文獻[13]中的方法，對流份進行逐級稀釋及滋味評價，確定具有酸味的特征流份，合并酸味特征流份，冷凍干燥（預凍溫度：-18 ℃；冷凍干燥溫度：-53 ℃；冷凍干燥時間：24 h）后得到酸味特征組分。需要指出的是，滋味評價過程中，評價人員每次的樣品品嘗量為10 μL，低于一支卷煙的攝入量。

1.2.2 酸味特征組分的定性分析

采用BSTFA 衍生化法測定酸味特征組分[18]，衍生化反應后進行GC/MS 分析。分析條件：

進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：恒流模式；分流比：50∶1；進樣量：1 μL；載氣及流速：He（99.999%），1 mL/min；程序升溫：50 ℃（1 min）280 ℃（3 min）；電離方式：電子轟擊（EI）；電離能量：70 eV；溶劑延遲：0 min；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：全掃描；掃描質量數范圍：33～450 amu。采用NIST11 和Wiley 譜庫匹配定性。

1.2.3 酸味特征組分的定量分析

取2 張劍橋濾片，加入20 mL 含內標（反式-3-己烯酸，濃度：5 μg/mL）的丙酮溶液，室溫萃取30 min，衍生化后進行GC/MS 分析[18]，每個樣品測定2 次，取平均值。GC/MS 分析條件同1.2.2 節(jié)；掃描模式：選擇離子掃描，根據保留時間劃分時間段。待測化合物保留時間、定性及定量離子的參數選擇見表1。

表1 酸味成分及內標保留時間和選擇離子Tab.1 Retention times and selected ions of sour components and internal standard

1.2.4 酸味成分味覺閾值測定和味覺活性值計算

采用GB/T 22366—2008《感官分析 方法學 采用三點選配法（3-AFC）測定嗅覺、味覺和風味覺察閾值的一般導則》中最優(yōu)估計閾值（Best estimate threshold, BET）法測定酸味成分的味覺閾值[21]。

以品牌卷煙中各物質質量分數與其味覺閾值的比值，作為該物質在卷煙中的TAV。以所得TAV 為依據，判定各成分對于卷煙煙氣酸味的貢獻。

1.2.5 酸味成分在卷煙中的作用驗證

為明確酸味成分在卷煙中的作用，對參比卷煙進行酸味成分組群的加香注射，感官評價對比加香前后參比卷煙的感官特征差異。考慮到各成分在側流煙氣的損失和自身轉移率的限制，所有成分的注射量均為對應成分在參比卷煙TPM中質量分數的10倍，加香溶液的溶劑為蒸餾水。

由15 位具有省級或以上資質的評吸人員組成卷煙感官評價小組。借鑒YC/T 497—2014[22]及YC/T 496—2014[23]推薦的中式卷煙風格感官評價方法和卷煙感官舒適性評價方法，從味覺風格、煙氣香韻、舒適感特性、煙氣特性4 個方面對卷煙進行感官評價，各指標最終評吸結果為15 位評委所給出分值的均值。

2 結果與討論

2.1 主流煙氣粒相物的GPC 感官導向分離

實現主流煙氣粒相物感官特征組分分離的關鍵是選擇合適的色譜分離材料。研究表明，感官刺激物分子和人體感覺器官表面受體產生的相互作用是感官刺激產生的關鍵。而各種不同的感官受體均只能與一定空間體積和結構的分子發(fā)生相互作用[24]。GPC分離是基于分子體積差異性的分離技術，因此有可能完成對相似感官特征分子的有效分離和富集[4]；同時，GPC 可用水作為流動相，有利于感官評價人員直接評價分離流份的味覺特征。因此，選擇GPC 作為主流煙氣粒相物的分離手段。

主流煙氣粒相物水溶液所得分離流份滋味特征評價結果如圖1 所示。在所得流份中出現了辣、酸和苦味3 種味覺特征。從流份6 開始，辣感和酸味同時出現，且以辣感為主，從流份8 開始，辣感逐漸減弱，酸味增加，并逐漸出現苦味。從流份11 開始，辣感和酸味消失，出現較純粹苦味并持續(xù)至流份30?；谧涛短卣髟u價結果，將具有明顯酸味特征的8～10 流份合并，冷凍干燥后得到酸味特征組分。

圖1 卷煙主流煙氣粒相物分離流份滋味特征評價結果Fig.1 Results of taste characteristics of fractions separated from TPM of mainstream cigarette smoke

2.2 主流煙氣粒相物中酸味成分的定性分析

酸味形成的生物學機理在于質子刺激舌黏膜引起的味感，因此酸味化合物多為有機酸[25]。分析前先采用BSTFA 為衍生化試劑將其硅烷化，使其在非極性柱上的峰形更加對稱，有助于定量分析。根據定性結果（圖2）及定性成分標準品的味覺特征評價，最終鑒定出卷煙主流煙氣粒相物中15 種酸味成分（表2）。

圖2 卷煙樣品主流煙氣粒相物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of TPM of mains tream cigarette smoke of sample

另外，為進一步驗證15 種酸味成分的味覺特征，將其標準品配制成兩種濃度的水溶液，評價其味覺特征，結果見表2?？芍?5 種成分均具有酸味；此外，8 種成分還具甜味，5 種成分有澀感，4-甲基-2-羥基戊酸的甜味和澀味特征明顯，3-甲基-2-羥基丁酸和亞甲基丁二酸的澀感特征明顯。

2.3 主流煙氣粒相物中酸味成分的定量分析

用選擇離子掃描的方式對TPM中的酸味成分進行定量，標準工作溶液及卷煙樣品的選擇離子掃描圖如圖3 所示。12 種不同品牌卷煙主流煙氣粒相物中酸味成分質量分數的測定結果見表3。

總體來看，乙酸、乳酸兩種酸味成分在各品牌卷煙主流煙氣粒相物中的質量分數明顯高于其他13種酸味成分；另外，不同品牌卷煙間乳酸在主流煙氣粒相物中的質量分數差異較大，如6 號卷煙幾乎是其他常規(guī)烤煙型卷煙的2～3 倍，這說明乳酸質量分數的差異可能是人為調控的，而同類型、不同品牌卷煙主流煙氣粒相物間乙酸質量分數的差異并不明顯。除此之外，3 種低焦油卷煙主流煙氣粒相物中乙酸

質量分數低于常規(guī)烤煙型及混合型卷煙，所測混合型卷煙主流煙氣粒相物乳酸質量分數低于其他類型的卷煙。

表2 15 種酸味成分及其兩種濃度水溶液中的味覺特征評價結果Tab.2 Results of taste characteristics of 15 sour components and their aqueous solutions at two concentrations

圖3 標準工作溶液及卷煙樣品的選擇離子掃描（SIM）圖Fig.3 Selected ion scan spectra of standard working solution and cigarette sample

除乙酸和乳酸外，羥基乙酸主流煙氣粒相物中的質量分數也較高，不同品牌卷煙主流煙氣粒相物中羥基乙酸質量分數的差異不大；與乳酸類似，混合型卷煙主流煙氣粒相物中羥基乙酸的質量分數也略低于其他兩種類型的卷煙。此外，由表2 的味覺評價結果可知，乳酸及羥基乙酸除具有酸味外，還有甜味，因此這些化合物在影響卷煙酸味的同時，也極有可能對其甜味造成影響。

此外，3-羥基丙酸、乙酰丙酸、2,3-二羥基丙酸等化合物質量分數處于相對較高水平，在品牌間及不同類型卷煙間的質量分數差異不大。丁二烯酸的質量分數也相對較高，但在低焦油卷煙主流煙氣粒相物中的質量分數明顯低于常規(guī)烤煙型和混合型卷煙。2-甲基丁酸、2-羥基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-甲基-2-羥基戊酸、亞甲基丁二酸具有澀感的成分在粒相物中的質量分數較低，且品牌間的差異不明顯。

2.4 酸味成分的感官貢獻分析

僅以不同酸味成分在主流煙氣粒相物中的質量分數高低并不能判斷其對酸味貢獻的差異，因此，測定了15 種酸味成分的味覺閾值，結果見表4。結合各成分在12 種品牌卷煙主流煙氣粒相物中的質量分數分布，計算得到對應的TAV（表5），以TAV 的大小衡量15 種成分對酸味的貢獻[20,26-27]。

在15 種酸味成分中，乙酸和乳酸對酸味貢獻較高，TAV 均遠高于其他13 種化合物，這是因為兩者的味覺閾值相對較低且質量分數較其他13 種酸味成分高。將各品牌卷煙15 種酸味成分的TAV 之和、乙酸與乳酸的TAV 之和對比（圖4）發(fā)現兩者具有相同的變化趨勢，因此可以認為乙酸與乳酸的TAV 之和能夠在很大程度上表征酸味成分組群對卷煙總體酸味感受的影響。

常見的研究報道中，常常將乙酸的嗅覺與味覺感受不加區(qū)分[17-19]。本研究中除了乙酸的味覺閾值外，還測定了其在乙醇中的嗅覺閾值（Oder activity value，OAV），見表4。通過計算可知乙酸的OAV 約為其TAV的2.5 倍，說明雖然乙酸是一種重要的酸味物質，但其感官貢獻以嗅覺（酸香）為主。另外，乳酸的TAV 也較高，不同品牌間乳酸的質量分數差異較大，其TAV 也顯示出了較大的差異，6 號卷煙乳酸的TAV 幾乎是其他卷煙乳酸TAV 的2～3 倍。

除乙酸和乳酸外，羥基乙酸質量分數相對較高，其TAV 也相對較高。丁二酸的閾值在15 種酸味成分中最低，但粒相物中丁二酸的質量分數并不高，所以其TAV低于乙酸和乳酸。丁二烯酸在常規(guī)烤煙型及混合型卷煙主流煙氣粒相物中的TAV 也較高，但在低焦油卷煙主流煙氣粒相物中的質量分數偏低，導致其在低焦油卷煙中的TAV 相對較低?；诒?中的感官評價結果，乳酸、羥基乙酸及丁二酸除具有酸味外，還具有甜味感受，且其TAV 值均相對較高，因此這些化合物影響卷煙酸味感受的同時，對甜味感受也會有較大的影響。

在帶有澀感的化合物中，除了2-羥基丁酸的TAV稍高，2-甲基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-甲基-2-羥基戊酸、亞甲基丁二酸的TAV均處于較低水平，因而與甜味相比，對卷煙澀感的影響不大。

將各品牌卷煙15 種酸味成分的TAV 加和，表征其對卷煙酸味的總體貢獻，結果見表5。以化合物在單支卷煙的TAV 加和計算，常規(guī)烤煙型卷煙的單支卷煙酸味強度要高于低焦油和混合型卷煙，而從化合物在主流煙氣粒相物中的TAV 加和來看，低焦油與常規(guī)烤煙型卷煙的酸味強度差異不大，但混合型卷煙的酸味強度較低，這與常規(guī)烤煙型和混合型卷煙抽吸的感官特征差異性一致。雖然低焦油卷煙的焦油量降低，但其酸味強度與常規(guī)烤煙型卷煙仍保持在同一水平，符合二者的抽吸感受。

綜上分析可知，與基于經驗篩選研究對象進而通過TAV 定位關鍵物質的研究思路不同，本研究中以TPM 為起始研究對象，感官導向分離其中的酸味流份，進而從酸味流份中定位得到了15種酸味成分，獲得了脂肪酸、羥基酸、烯酸等多種對卷煙酸味貢獻強度各異的化合物，且大部分化合物除了主要的酸味外，還具有甜味、澀感等。

表4 15 種酸味成分的閾值Tab.4 Threshold values of 15 sour components(μg·g-1)

2.5 酸味成分的加香評吸結果

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圖4 12 種卷煙樣品主流煙氣粒相物中15 種酸味成分TAV 之和及乙酸和乳酸的TAV 之和Fig.4 Sum of TAVs of 15 sour components and that of acetic acid and lactic acid in mainstream cigarette smoke of 12 samples

圖5 空白卷煙（藍色）和添加酸味成分的卷煙（紅色）的感官特征對比Fig.5 Comparison of sensory characteristics between blank cigarette（blue）and cigarettes added with sour components（red）

空白卷煙和添加酸味成分的卷煙的味覺風格、煙氣香韻、舒適感和煙氣特性對比如圖5 所示?？梢钥闯?，添加了酸味成分組群的卷煙酸味口感明顯提升，進一步說明本研究中定位的15 種酸味成分具有有效的酸味調節(jié)作用，是卷煙重要的酸味成分；除此之外，卷煙的甜味口感也有所提升，符合部分酸味成分兼具甜味的感官感受。加入酸味成分后，煙氣的甜香、果香明顯增強，其余香韻基本不變；同時明顯降低了煙氣的刺激和雜氣，改善了余味，提高了煙氣的細膩程度。

3 結論

利用凝膠色譜分離技術對卷煙主流煙氣總粒相物進行了流份分離，在感官導向下定位了酸味組分，并利用GC/MS 技術鑒定了15 種酸味物質：①TAV 顯示15 種酸味成分均對卷煙味覺有貢獻，乙酸和乳酸對酸味的貢獻最大；不同卷煙品牌間乳酸的TAV 差異較大，人為調控因素較高；②部分酸味成分具有甜味及澀感表現；③評吸結果顯示，施加酸味成分能夠降低卷煙刺激性、改善余味，明顯提高卷煙的酸味口感、甜香香韻及甜味口感。