董珊珊，段存娟，郭 英，石麗媛，鐘佑宏，李 偉，王 鵬

（1.云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點實驗室 云南公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，大理 671000；2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206）

鼠疫是一種由鼠疫耶爾森氏菌引起的自然疫源性烈性傳染病，診斷鼠疫的方法主要包括細菌學、免疫學及基因檢測等，不同的檢測對象適應的檢測方法也不同。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） 作為檢測鼠疫菌的方法已被廣泛應用[1]。該技術(shù)多以鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）的caf1及pla二基因的片段作為目標基因來檢測。caf1基因位于編碼F1抗原的pMT1質(zhì)粒上，pla基因位于pPCP1質(zhì)粒上。質(zhì)粒是一種不穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，國外有關(guān)于缺失pPCP1質(zhì)粒的鼠疫菌[2]及缺失pMT1質(zhì)粒的鼠疫菌[3]的分離報道，國內(nèi)也已有缺失株的報道[4]。因此只采用針對質(zhì)粒基因進行診斷的方法，具有一定的誤診與漏診的可能性。周冬生等[5]通過比較基因組雜交，發(fā)現(xiàn)28條鼠疫菌獨有基因，鑒定表明這28條位于染色體上的基因片段是鼠疫菌的標識DNA序列[6]，穩(wěn)定且不易丟失?；谶@一研究結(jié)果，本實驗室篩選出位于鼠疫菌染色體上的YPO0392，作為鼠疫菌的特異性引物，可用于鼠疫特異診斷[7]。本研究選擇caf1及YPO0392基因作為靶點，分別設計引物和不同熒光標記TaqMan探針，經(jīng)過體系優(yōu)化后，將2種基因放在一個反應體系中同時進行檢測，兼顧反應體系的獨立性、高效性、靈敏度、特異性，達到簡便快速檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 菌株及DNA制備 鼠疫菌20株，非鼠疫菌25株見表1。用酚氯仿法提取鼠疫菌DNA[8]；非鼠疫菌DNA采用天根有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。所有實驗菌株均由云南省地方病防治所鼠疫中心實驗室保存提供。

表1 本研究所用菌株情況Table 1 Strains used in this study

1.2 現(xiàn)場材料DNA樣本2012年4月在云南省麗江市玉龍縣采集干燥自斃齊氏姬鼠及大絨鼠骨髓及肌肉樣本共8份，采用QIAGEN的DNA試劑盒進行提取[9]，經(jīng)普通PCR引物caf1及YPO0392進行擴增，均出現(xiàn)目的DNA片段。24份樣本來源于云南省麗江市玉龍縣齊氏姬鼠及大絨鼠盲腸，采用天根有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。經(jīng)普通PCR引物caf1進行擴增，均未出現(xiàn)目的DNA片段，結(jié)果陰性。所用樣本均由鼠疫中心實驗室提供。

1.3 引物及探針選擇鼠疫菌質(zhì)粒上的caf1特異性靶基因及染色體上的YPO0392特異性靶基因進行引物和探針的設計，使用TaqMan探針，并分別標記FAM及VIC熒光，合成一體系雙引物caf1／YPO0392。敏感性試驗中兩個單引物caf1和YPO0392均使用TaqMan探針，標記FAM熒光。所用引物、探針及熒光標記物均由上海輝睿生物科技有限公司合成，具體見表2。

表2 本研究所用引物和探針序列Table 2 Primer and probe sequences used in this study

1.4 實時熒光定量PCR總反應體系為25.0 μL：HR QPCR Master Mix 12.5 μL，引物反應液7.5 μL（引物上下游及探針濃度均為10 μmol/L），待測模板DNA 5 μL。反應參數(shù)： 95℃預變性5 min； 95℃變性10 s，58℃退火45 s，40個循環(huán)。CT值＜35，判為陽性結(jié)果；CT值≥38或沒有峰值，判為陰性結(jié)果；35≤CT值＜38，重復判定兩次[10]。

1.5 敏感性試驗將濃度為17.93 ng/μL的鼠疫菌EV76 DNA用滅菌去離子水進行10倍系列稀釋，共7個梯度，分別與caf1/YPO0392、caf1、YPO0392三種引物反應液進行熒光PCR檢測。滅菌去離子水作為空白對照。

1.6 特異性和穩(wěn)定性試驗一體系雙引物caf1/YPO0392與19份鼠疫菌DNA進行實時熒光定量PCR穩(wěn)定性驗證；與25份非鼠疫菌DNA進行實時熒光定量PCR特異性驗證。滅菌去離子水作為空白對照。

1.7 一體系雙引物caf1/YPO0392的現(xiàn)場應用一體系caf1/YPO0392引物反應液與8份鼠疫陽性的DNA模板及24份鼠疫陰性的DNA模板進行實時熒光PCR定性試驗。滅菌去離子水作為空白對照。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗用滅菌去離子水將鼠疫菌EV76 DNA按10倍系列稀釋7個梯度，DNA濃度在17.93×100～17.93×10-7ng/μL之間。一體系雙引物與兩個單引物同時檢測，對檢測結(jié)果進行比較，一體系雙引物和單引物的敏感度總體一致，以CT值小于35為判定標準，一體系引物可檢測到鼠疫菌DNA的濃度為17.93×10-5ng/μL（表3）。

2.2 特異性和穩(wěn)定性試驗一體系雙引物caf1/YPO0392與19份鼠疫菌DNA進行實時熒光定量PCR穩(wěn)定性驗證；與25份非鼠疫菌DNA進行實時熒光定量PCR特異性驗證。滅菌去離子水作為空白對照。在同等條件下與鼠疫菌DNA模板在15～22循環(huán)期間出現(xiàn)擴增曲線，與非鼠疫菌DNA模板均未出現(xiàn)擴增曲線（圖1）。

2.3 一體系雙引物caf1/YPO0392的現(xiàn)場應用一體系caf1/YPO0392引物反應液與8份已知鼠疫陽性的DNA模板及24份鼠疫陰性的DNA模板進行實時熒光PCR定性試驗，滅菌去離子水作為空白對照。結(jié)果顯示8份待測模板均出現(xiàn)擴增曲線，其CT值均在陽性范圍內(nèi)，24份待測模板均未出現(xiàn)擴增曲線（圖2）。

表3 單引物與雙引物檢測每個梯度EV76 DNA的CT值Table 3 CT values of each gradient EV76 DNA respectively detected by single primer and double primer

圖1 caf1/YPO0392對被試菌株DNA的熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.1 Fluorescent quantitative PCR result of the tested strains DNA using caf1/YPO0392

3 討論

云南省鼠疫自20世紀80年代復燃以來，一直不斷出現(xiàn)病例報道。2005年云南省首次發(fā)現(xiàn)肺鼠疫病例[11]。對于鼠疫這種傳播快、病程短、病死率高的烈性傳染病而言，建立準確、簡便、快速的診斷技術(shù)是預防控制措施中的關(guān)鍵。目前鼠疫菌的分子生物學檢測技術(shù)，主要為PCR、實時熒光定量PCR和基因芯片等技術(shù)，利用這些技術(shù)已經(jīng)研發(fā)出很多針對鼠疫菌的檢測方法[12]，選擇的靶位點均是鼠疫菌的特異性基因。隨著熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展和完善，特別是TaqMan[13]探針法被廣泛應用后，針對細菌核酸的保守序列設計特異的引物和熒光探針，進行熒光PCR擴增，成為檢測病原體核酸常用的一種方法[14]。國外學者主要是針對單基因采用 FAM 單熒光素標記的Taqman 探針方法[15-17]，達到快速檢測鼠疫菌的目的。常規(guī)的單基因位點檢測方法，多以caf1及pla基因為靶標，但某些鼠疫菌株缺失編碼caf1及pla基因的質(zhì)粒，易導致漏檢。

雙重熒光定量PCR檢測技術(shù)因具有快速、特異、準確等優(yōu)點，在很多領(lǐng)域被廣泛應用[18,19]。本研究選擇了鼠疫菌pMT1質(zhì)粒上的caf1基因以及鼠疫菌染色體上的YPO0392基因，根據(jù)熒光定量PCR的引物設計原則，分別對這2個基因的保守區(qū)設計引物和探針?？紤]到反應體系的獨立性和高效性，對caf1基因的探針采用FAM熒光素標記，對YPO0392基因的探針采用VIC熒光素標記。經(jīng)過體系優(yōu)化后，將2種基因放在一個反應體系中同時進行檢測，即在一個反應管中針對鼠疫菌的質(zhì)粒和染色體序列同時擴增并獨立檢測目標。與單體系熒光定量PCR相比，實驗體系優(yōu)化過程中需要較長的時間和精力，但可以提高樣品的陽性檢出率，防止質(zhì)粒缺失和基因突變引起的漏檢。本次試驗中19株鼠疫菌來源于不同地點、不同時期、不同宿主的云南省家鼠、野鼠鼠疫疫源地，在疫源地地理位置分布、菌株生物學特征、流行年代上都具代表性；所采用的25株非鼠疫菌包括了與鼠疫菌同屬的假結(jié)核耶爾森氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌及其他種類的細菌；所采用的現(xiàn)場材料DNA樣本均來源于云南省麗江野鼠型疫源地。檢測結(jié)果顯示，該方法具備良好的特異性和穩(wěn)定性，敏感度為17.93×10-5ng/μL，達到了單基因caf1和單基因YPO0392的水平。

圖2 caf1/YPO0392對現(xiàn)場材料的熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.2 Fluorescent quantitative PCR testing result of site materials by Caf1/YPO0392

本研究建立的兩套引物探針同時進行PCR檢測鼠疫的方法，檢測結(jié)果可相互驗證，避免由于使用單一引物造成的漏檢，有效提高了結(jié)果的準確性；另一方面，放在同一個反應體系中進行檢測，可降低合成成本，減少試劑與待測樣本的用量，又提高了工作效率。因此，該方法有很強的實用性和推廣價值，將能代替單基因檢測鼠疫耶爾森氏菌的方法，成為今后鼠疫基因檢測的首選方法。