郭 健 ，張 月 ，李 艷 ，董 媛 ，劉 微 ，楊艷玲

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 132013；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130122）

布魯菌?。╞rucellosis）和結(jié)核病（tuberculosis）是危害畜牧業(yè)較嚴(yán)重的兩類人獸共患傳染病，牛、羊、鹿、豬、犬是主要易感動(dòng)物[1-3]。前者由布魯菌（Brucella）引起[4]，后者由牛分枝桿菌復(fù)合群（M.tuberculosis complexand）或牛分歧桿菌（M. bovis）引起[5]。布魯菌病簡稱布病，可引起雌性動(dòng)物流產(chǎn)和繁殖力下降，雄性發(fā)生關(guān)節(jié)炎、睪丸炎和產(chǎn)茸量降低等[6]。結(jié)核病可致動(dòng)物多個(gè)器官發(fā)生結(jié)核，體型消瘦，最后器官衰竭而死亡[7]。布病和結(jié)核病都屬于人畜共患、多宿主感染的慢性傳染病，不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大損失，也對(duì)公眾的健康造成嚴(yán)重危害，是世界范圍的重要公共衛(wèi)生問題之一[8,9]。

目前世界各國對(duì)動(dòng)物布病和結(jié)核病的防治措施主要是“檢疫-撲殺”，因此準(zhǔn)確的診斷顯得尤為重要。當(dāng)前，動(dòng)物布病的診斷方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)（Rose- Bengal plate agglutination test，RBT）、試管凝集試驗(yàn)（serum tube agglutination test，SAT），但這些診斷方法存在判定標(biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)格，特異性差的缺點(diǎn)[10,11]。結(jié)核病使用傳統(tǒng)的皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（purified protein derivative，PPD）和血-γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（interferon-gamma release assay，IGRA）來篩查感染動(dòng)物，這兩項(xiàng)技術(shù)操作繁瑣，同時(shí)也存在特異性差、敏感性低的缺點(diǎn)[12,13]。檢測技術(shù)的不完善給布病和結(jié)核病的診斷和防治帶來諸多困難，從而造成兩種傳染病在養(yǎng)殖動(dòng)物中廣泛流行。因此，建立一種快速簡單、敏感性強(qiáng)、特異性高、低成本的診斷方法勢(shì)在必行。本研究利用羊種布魯菌LPS和重組牛分歧桿菌MPB70蛋白作為檢測抗原，研制的同時(shí)檢測動(dòng)物布病和結(jié)核病的膠體金抗體檢測試紙條用于動(dòng)物布病和結(jié)核病的臨床快速診斷。

1 材料與方法

1.1 菌種、血清和動(dòng)物羊種布魯菌強(qiáng)毒株16M（B.melitensis，16M）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。血清樣品采集自吉林省敦化市、左家鎮(zhèn)、東風(fēng)縣養(yǎng)殖場和湖南吉湘鹿場；新西蘭大白兔（2～4 kg）購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 試劑重組牛分歧桿菌MPB70蛋白，前期由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)并純化[14]；LPS定量試劑盒購自泉州科諾迪生物；DNA酶、 RNA酶、蛋白酶K購自Thermo公司；Brucella broth購自Acumedia公司；銀染試劑盒購自Bio-Rad公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、BSA購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 材料30 nm膠體金溶液、硝酸纖維素膜（Sartorius CN 140）、結(jié)合墊（PALL XQ-Y2，玻纖膜）、樣品墊(Ahlstrom 8964，玻纖膜）、吸收墊、PVC底板、塑料卡均購自上海杰一生物技術(shù)公司。

1.4 抗原抗體制備

1.4.1 布魯菌LPS的提取和純化 將羊種布魯菌16M 接種于Brucella Broth液體培養(yǎng)基中。37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=1.2～1.5，將菌液83℃水浴滅活30 min。5000×g離心收集菌體，PBS洗滌2次，重懸備用。按照改良后的熱酚法[15]提取16M的LPS。粗提LPS經(jīng)超純水透析，PEG8000濃縮后，加DNA酶和RNA酶各50 μg/mL，37℃酶解2 h。再加15 μg/mL蛋白酶K，37℃酶解1 h。冰浴冷卻，1500×g離心20 min，上清液加2倍體積無水乙醇，沉淀后獲得LPS，用LPS定量試劑盒測定濃度。純化后的LPS經(jīng)SDS-PAGE分離、銀染后檢測。

1.4.2 LPS的免疫原性分析 用提取的LPS作為抗原，自然感染布魯菌的鹿陽性血清和牛陽性血清（RBT和ELISA試劑盒檢測均為陽性）作為抗體進(jìn)行瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)[16]，37℃溫箱孵育24 h后，觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.4.3 兔抗LPS、MPB70多克隆抗體的制備 使用純化的LPS和MPB70蛋白作為抗原分別免疫新西蘭大白兔。采用背部皮下多點(diǎn)注射，分別于第0、2、4、6周共免疫4次。第1次免疫前將抗原按照1∶1的比例與弗氏完全佐劑充分混合，后3次免疫采用抗原按照1:1的比例與弗氏不完全佐劑充分混合。每次免疫抗原量為400 μg/只。第7周心臟取血。37℃放置析出血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 抗原標(biāo)記條件確定

1.5.1 膠體金標(biāo)記LPS和MPB70蛋白最佳pH值確定取20支離心管，每組各10支。每管加1 mL膠體金溶液，用3% K2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值（表1）。分別向兩組離心管中加80 μg LPS和MPB70蛋白，充分混勻后，靜置30 min。再分別向上述各管加入 100 μL 10% NaCl溶液，充分混勻后，靜置1 h。通過OD550值[17]檢測并結(jié)合肉眼觀察來確定最佳pH值。OD550值最大處對(duì)應(yīng)pH值為最佳，維持溶液紅色最小pH值為最佳。

表1 每管膠體金溶液的pH值Table 1 pH of each colloidal gold solution

1.5.2 膠體金標(biāo)記LPS和MPB70蛋白最佳濃度確定 將膠體金溶液調(diào)至最佳pH值，分別添加1 mL到每支離心管中，按照 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg 的抗原量分別向每組的10支離心管中加入LPS和MPB70蛋白，充分混勻后，靜置30 min；再加入100 μL 10% NaCl溶液，充分混勻后，靜置1 h，通過OD550值檢測并結(jié)合肉眼觀察來確定抗原最低標(biāo)記濃度。OD550值為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線平衡拐點(diǎn)處對(duì)應(yīng)最低標(biāo)記濃度（維持溶液紅色的最低濃度）。最佳標(biāo)記濃度=最低濃度×120%。

1.6 金標(biāo)墊的制備3%K2CO3調(diào)節(jié)膠體金pH值分別為7.5（LPS組）、7.7（MPB70組）；根據(jù)最佳濃度添加抗原，充分混勻，靜置30 min；再加BSA至終濃度1%，繼續(xù)攪拌20 min，靜置15 min使抗原與膠體金顆粒穩(wěn)定結(jié)合。將結(jié)合墊置于封閉液（pH7.4，0.01 mol/L PBS，含1%BSA、0.2% Tween-20和5 mmol/L NaCl）中，37℃封閉30 min。處理好的結(jié)合墊切割成寬度0.40 cm的長條。在金標(biāo)抗原中加0.2%蔗糖，充分溶解后，均勻地加到金標(biāo)結(jié)合墊上至飽和，室溫晾干，即為金標(biāo)墊。

1.7 檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）劃膜將硝酸纖維素膜（有背襯）浸入甲醇溶液內(nèi)敏化10 min。將膜至于處理液（pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含0.2%Tween-20、5 mmol/L NaCl和5 mmol/L蔗糖），37℃浸泡30 min，PBS 洗滌2次，常溫晾干。LPS和MPB70蛋白T線的抗原噴膜濃度分別0.25 mg/mL和0.5 mg/mL。C線上LPS和MPB70蛋白多克隆抗體劃線量分別為1 μL/cm和2 μL/cm。用JY-EQ03 連續(xù)式劃膜儀將抗原抗體包被在硝酸纖維素膜上，包被后用1% BSA封閉30 min，4℃干燥。

1.8 樣品墊處理用0.01 mol/L PBS（含3% BSA和1%Tween-20，pH 7.4）浸泡樣品墊，常溫晾干。

1.9 試紙條組裝及結(jié)果判定依次將硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸收墊粘貼到PVC底板。分切試紙條寬度為4 mm，組裝雙聯(lián)檢測卡。檢測時(shí)，向樣品孔處加樣（3～5倍稀釋的新鮮血清）100 μL，10 min后判定結(jié)果。根據(jù) T 線、C 線的顯色條帶判定樣品為陽性、陰性或者是試紙條失效（C線不顯色）。

1.10 特異性試驗(yàn)用制備的試紙條分別對(duì)牛、鹿布魯菌病血清、結(jié)核病血清、口蹄疫血清、巴氏桿菌病血清、耶爾森氏菌病血清進(jìn)行檢測，觀察有無交叉反應(yīng)。

1.11 敏感性試驗(yàn)將鹿布魯菌病血清（RBT和SAT檢測均強(qiáng)陽性）和結(jié)核病血清（PPD和γ-干擾素ELISA檢測均強(qiáng)陽性）進(jìn)行倍比稀釋后，使用試紙條進(jìn)行檢測，記錄顯示陽性的最大稀釋倍數(shù)。

1.12 符合率檢測對(duì)臨床采集的206份牛血清和387份鹿血清進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、γ-干擾素ELISA和試紙條檢測，比對(duì)符合率，評(píng)價(jià)試紙條檢測結(jié)果的可靠性。

1.13 臨床樣品檢測組建3000條檢測卡，在琿春市、圖們市、敦化市、舒蘭市、長嶺縣，長白朝鮮族自治縣、四平市等地開展了推廣試驗(yàn)，在基層養(yǎng)殖場進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌LPS提取用改良的熱酚法提取羊種布魯菌強(qiáng)毒株16M的LPS，純化后用LPS定量試劑盒檢測濃度為0.23 mg/mL。經(jīng)SDS-PAGE分離、銀染檢測，顯示提取的LPS為均勻抹帶（圖1）。

圖1 布魯菌LPS經(jīng) SDS-PAGE銀染結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE with silver staining of Brucella LPS

2.2 LPS免疫原性分析LPS瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，中間孔為提取的LPS，1～5孔分別為自然感染布魯菌的鹿和牛陽性血清，6為PBS對(duì)照孔。結(jié)果顯示，LPS孔周圍均出現(xiàn)明顯的沉淀線，證明提取的LPS具有較強(qiáng)的免疫原性。

圖2 LPS與布魯菌陽性血清的瓊脂糖免疫擴(kuò)散反應(yīng)Fig.2 Agarose immunodiffusion reaction between LPS and Brucella positive serum

2.3 抗原最佳標(biāo)記pH值和標(biāo)記濃度根據(jù)pH值-吸光值曲線（圖3A）及肉眼觀察，LPS與膠體金結(jié)合的最佳pH值為1 mL膠體金溶液中加入 3% K2CO3溶液6 μL，即pH值7.5。MPB70蛋白與膠體金結(jié)合的最佳pH值為1 mL膠體金溶液中加入3% K2CO3溶液8 μL，即pH值7.5。根據(jù)濃度-吸光值曲線（圖3B）及肉眼觀察，LPS最低標(biāo)記濃度為30 μg/mL，則最佳標(biāo)記濃度為30×120%=36（μg/mL）。MPB70蛋白的最低標(biāo)記濃度為20（μg/mL），則最適蛋白濃度為20×120%=24（μg/mL）。

圖3 抗原最佳標(biāo)記pH值（A）和濃度(B)確定Fig. 3 Determining of the antigen optimal labeling pH（A）and optimal labeling concentration(B)

2.4 試紙條組裝和結(jié)果判定試紙條組裝如圖4A 所示：1—硝酸纖維素膜、2—金標(biāo)墊、3—樣品墊、4—吸收墊、5—PVC底板。將試紙條組裝成雙聯(lián)檢測卡。判定結(jié)果如圖4B 所示， 可同時(shí)對(duì)檢測動(dòng)物布魯菌病和結(jié)核病進(jìn)行檢測，試紙條顯示的條帶清晰，顯色穩(wěn)定，無拖帶，能較好地鑒別臨床上布魯菌病和結(jié)核病的陰性和陽性。

圖4 膠體金試紙條Fig.4 Colloidal gold test strip

2.5 特異性測試用制備的試紙條分別對(duì)牛鹿布魯菌病血清、結(jié)核病血清、口蹄疫血清、巴氏桿菌病血清、耶爾森氏菌病血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)，證明試紙條特異性良好（BR:布魯菌?。籘B：結(jié)核?。?。

2.6 敏感性試驗(yàn)?zāi)z體金試紙條檢測倍比稀釋的布魯菌病和結(jié)核病陽性血清，顯示可檢測到陽性的血清最大稀釋倍數(shù)均為1∶512。

2.7 符合率檢測對(duì)臨床采集的206份牛血清和387份鹿血清進(jìn)行檢測。比對(duì)虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）和膠體金試紙條檢測（GICA）檢測結(jié)果、反芻動(dòng)物結(jié)核γ-干擾素ELISA（IGRA）和膠體金試紙條檢測結(jié)果的符合率，檢測結(jié)果如表3所示。

RBT檢測布魯菌病總陽性率為6.57%，GICA檢測布魯菌病總陽性率為10.3%；GICA與RBT方法比較，陽性符合率100%，陰性符合率為96%，總符合率為96%。IGRA檢測結(jié)核病總陽性率為21.2%，GICA檢測結(jié)核病總陽性率為22.4%；GICA與IGRA方法比較，陽性符合率94%，陰性符合率為97%，總符合率為96%。比較結(jié)果說明兩組方法符合性較好。

2.8 臨床樣品檢測采用試紙條檢測卡在基層養(yǎng)殖場進(jìn)行現(xiàn)場檢測，結(jié)果清晰，判定簡單。部分檢測結(jié)果如圖5所示。

圖5 臨床樣品檢測結(jié)果Fig.5 Partial clinical test results of test strips

表2 試紙條特異性檢測Table 2 Specific detection of colloidal gold test strip

表3 GICA、RBT和IGRA三種方法檢測結(jié)果Table 3 Comparison of detection results of GICA, RBT and IGRA

3 討論

布魯菌病和結(jié)核病都是危害動(dòng)物健康養(yǎng)殖和公共衛(wèi)生安全的重要人畜共患傳染病[18]。目前，有170多個(gè)國家和地區(qū)存在布病流行，因其造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)約30億美元[19]。同時(shí)，結(jié)核病作為世界危害最大的人畜共患病之一[20]，在人和動(dòng)物間具有廣泛的傳播性，自1993年世界衛(wèi)生組織就宣布結(jié)核病已成為公共健康急癥[21]。大量數(shù)據(jù)顯示人類布病和結(jié)核病的發(fā)病率與畜間布病和結(jié)核病的發(fā)病率呈正相關(guān)。近年來檢測技術(shù)不斷革新。宮曉煒等[22]利用BP26作為包被抗原，建立的iELISA方法，與SAT檢測結(jié)果符合率達(dá)93%。王志明等[23]利用Brucella-5C10 作為競爭抗體，建立了cELISA 方法，減少了假陽性的出現(xiàn)。王素華等[24]、杜琳等[25]設(shè)計(jì)了omp31、omp25特異性引物，PCR擴(kuò)增測序，符合率達(dá)99%。Queiros等[26]和Wadhwa等[27]分別利用結(jié)核菌蛋白抗原別建立ELISA和EVELISA（乙醇渦 ELISA）排除感染結(jié)核菌的偶蹄動(dòng)物，特異性良好。楊雷[28]利用PCR擴(kuò)增結(jié)核菌HSP65 基因片段檢測鹿結(jié)核病。王春雨[29]研究發(fā)現(xiàn)TaqMan PCR檢測結(jié)核病特異性優(yōu)于ELISA。雖然報(bào)道的ELISA和PCR方法結(jié)果良好，但目前多處于實(shí)驗(yàn)室研究層面，應(yīng)用于基層快速檢測仍存在困難。

膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）具有特異性好，敏感性高，肉眼可讀，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，近年來在動(dòng)物疾病診斷和檢疫中得到廣泛應(yīng)用[30]。LPS是細(xì)菌表面毒力因子，可引起機(jī)體免疫應(yīng)答，是布魯菌特異性診斷方法常用的抗原，并且比其他蛋白抗原物質(zhì)穩(wěn)定持久。本研究優(yōu)化了LPS的提取方式，提高了純度和含量，更利于用LPS建立布魯菌快速診斷方法。MPB70蛋白是結(jié)核分枝桿菌的分泌型蛋白，具有較強(qiáng)的免疫原性。利用羊種布魯菌16M株的LPS和牛分枝桿菌MPB70蛋白作為抗原研制的膠體金抗體檢測試紙條，可同時(shí)檢測動(dòng)物布魯菌病和結(jié)核病，而且所有動(dòng)物都可以使用，更有利于臨床獸醫(yī)和飼養(yǎng)場進(jìn)行布病和結(jié)核病的診斷。將研制的試紙條檢測結(jié)果與布病的RBT方法比較，陽性符合率100%，陰性符合率為96%；與結(jié)核病γ-干擾素ELISA方法比較，陽性符合率94%，陰性符合率為96%。檢測結(jié)果證明試紙條具有較高的敏感性和特異性。由于RBT和γ-干擾素ELISA方法具有局限性，我們又結(jié)合ELISA抗體檢測試劑盒檢測不符合的樣品，結(jié)果與試紙條一致。

采用研制的試紙條在基層養(yǎng)殖場開展了推廣應(yīng)用，臨床測試效果良好，適用于養(yǎng)殖戶和基層獸醫(yī)現(xiàn)場檢測，也為動(dòng)物布病和結(jié)核病的凈化提供了技術(shù)保障。