姜盈盈，林 岳

黃柏最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，主要來(lái)源于蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense Schneid）的干燥樹皮，具有清熱燥濕、解毒療瘡等功效。研究發(fā)現(xiàn)，黃柏的藥理活性主要表現(xiàn)為抗炎、抗菌、抗病毒及抗氧化等[8]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，由黃柏、黃連等組方而成的黃連解毒湯在膿毒癥的治療中療效顯著，同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃柏堿是其中重要的入血成分[9]。黃柏堿為黃柏中的關(guān)鍵生物堿成分，其具有良好的降血壓和抗腎炎等活性[10-11]。黃柏堿參與了膿毒癥及腎炎的治療過程，而其對(duì)于膿毒癥并發(fā)急性腎損傷（AKI）是否存在潛在作用尚不清楚。因此本課題擬采用膿毒癥大鼠模型，通過治療考察黃柏堿的藥效活性、分析其潛在藥理機(jī)制，為膿毒癥并發(fā)AKI的治療提供新的治療策略，為黃柏及其相應(yīng)組方的臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠，雄性，8周齡，體重180～220 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005），購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于層流架中，自由進(jìn)食飲水，造模前12 h晝夜交替飼養(yǎng)3 d，保持恒溫條件。

1.2 主要試劑及儀器 黃柏堿（HPLC≥98%，H-100718-03），成都瑞芬思生物科技有限公司；Cr、BUN試劑盒，南京建成生物工程研究所；NGAL、KIM-1、IL-6、IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；TLR4及NLRP3抗體，美國(guó)Abcam公司；ECL顯影試劑盒，美國(guó)GE公司；SDS-PAGE試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，上海天能科技有限公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)，日本櫻花精機(jī)株式會(huì)；AX70顯微系統(tǒng)，日本Olympus公司；MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 模型建立 取健康大鼠，采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（CLP）方法[12]制備膿毒癥大鼠模型。首先采用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，在無(wú)菌工作臺(tái)中沿腹正中線切開，暴露大鼠盲腸。4-0絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸末端1.5 cm處，18號(hào)針頭在游離端穿透2次，擠出少許糞便，還納腸管并逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)大鼠僅探查盲腸，不結(jié)扎或穿孔。

1.4 分組與給藥 造模結(jié)束，取膿毒癥大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、黃柏堿低劑量組（100 mg/kg）、黃柏堿高劑量組（200 mg/kg）及氨芐青霉素鈉組（150 mg/kg），另取假手術(shù)大鼠設(shè)為假手術(shù)組，每組10只。給藥組尾靜脈注射相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組及模型組大鼠則給予0.5 mL生理鹽水。術(shù)后24 h眼眶取血，離心收集血清，隨后脫頸椎處死大鼠，取出腎臟，部分組織浸泡于10%甲醛溶液，部分勻漿后取上清液，剩余腎臟組織置凍存管，并放入-80℃冰箱保存。

1.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，檢測(cè)大鼠血清中腎損傷指標(biāo)（Cr、BUN、NGAL及KIM-1）以及炎性因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的含量。

1.6 腎臟病理變化檢測(cè) 從10%甲醛溶液中取出腎組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片，在光鏡下對(duì)腎組織病理改變進(jìn)行觀察。根據(jù)管狀上皮增生、刷狀緣消失、空泡變性及上皮脫落等鏡檢指標(biāo)進(jìn)行觀察。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)腎組織中TLR4及NLRP3蛋白表達(dá) 取腎組織全蛋白抽提液，根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書對(duì)上清液中蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)上樣緩沖液孵育后，各組取等量蛋白進(jìn)行凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。經(jīng)BSA封閉后加一抗TLR4（1:1000）及NLRP3（1:1000）在4℃進(jìn)行雜交孵育。次日在室溫中加二抗進(jìn)行孵育，通過滴加ECL顯影液進(jìn)行顯影成像，根據(jù)Image J軟件進(jìn)行灰度值半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型大鼠血清中炎癥因子（TNF-α、IL-6及IL-1β）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在TNF-α含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯抑制TNF-α的分泌，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）；在IL-6含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯抑制IL-6的分泌，其中以黃柏堿高劑量的作用顯著（P＜0.01）；在IL-1β含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉均可顯著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 各組大鼠血清Cr及BUN含量比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型大鼠血清中腎功能指標(biāo)（Cr及BUN）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在Cr含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低Cr的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）；在BUN含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低BUN的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β含量的比較

表2 各組大鼠血清Cr及BUN含量的比較

2.3 各組大鼠血清NGAL及KIM-1含量比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型大鼠血清中腎損傷標(biāo)志物（NGAL及KIM-1）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在NGAL含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低NGAL的含量，其中以黃柏堿高劑量的作用顯著（P＜0.01）；在KIM-1含量檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低KIM-1的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清NGAL及KIM-1含量的比較

2.4 各組大鼠腎臟組織病理結(jié)果 通過組織病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織間隙出現(xiàn)明顯水腫，可見彌漫嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球嚴(yán)重皺縮，而腎小管官腔閉塞，部分細(xì)胞腫脹、空泡變性，腎小管囊腔擴(kuò)張等。再給予黃柏堿低、高劑量及氨芐青霉素鈉治療后，大鼠腎組織中可見腎小管灶狀損害減輕，腎小管腫脹及空泡變性也均有改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及組織間隙水腫得到不同程度緩解，其中以黃柏堿高劑量及氨芐青霉素鈉的改善較佳。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色

2.5 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組大鼠比較，模型大鼠腎組織中TLR4表達(dá)水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在TLR4水平檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉均可顯著降低組織中TLR4蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）；在NLRP3水平檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低NLRP3的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

表4 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3表達(dá)水平的變化

圖2 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3表達(dá)水平的變化

3 討論

膿毒癥是指因病原體入侵機(jī)體后導(dǎo)致的一系列持續(xù)性過度炎癥及持續(xù)性免疫抑制反應(yīng)，是機(jī)體器官衰竭的重要因素，可導(dǎo)致患者休克甚至死亡[1]。膿毒癥是臨床常見的全身性危重綜合癥，在重癥監(jiān)護(hù)病房 (intensive care unit，ICU)中其病死率高達(dá)35%[2]，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全，給社會(huì)及患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者中并發(fā)AKI的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)50%，且該類患者預(yù)后較差，死亡率較高[5-6]。臨床常通過補(bǔ)液、靜脈滴注抗生素及利尿劑等策略實(shí)施膿毒癥AKI的治療，但膿毒癥AKI患者的高死亡率并未得到有效緩解[7]，因此探索新的膿毒癥AKI治療藥物，對(duì)緩解腎臟損傷、挽救患者生命與健康具有重大意義。

AKI是ICU期間常見的并發(fā)癥，由多種致病因素（膿毒癥、缺血缺氧及藥毒性）誘發(fā)而導(dǎo)致短期內(nèi)腎功能快速下降。AKI臨床表現(xiàn)主要包括腎小球?yàn)V過率降低、水電解質(zhì)紊亂、肌酐升高及尿量減少等。AKI通常伴有嚴(yán)重并發(fā)癥，通過干擾其他生理系統(tǒng)，導(dǎo)致體內(nèi)多臟器衰竭[13]，嚴(yán)重并發(fā)癥可使患者病死率提升至30%[14]。膿毒癥是AKI的主要因素[15]，中醫(yī)認(rèn)為膿毒癥屬“傷寒”“熱病”范疇，通常將其病機(jī)歸為“毒瘀互結(jié)”，而其所致AKI則為機(jī)體正氣虧虛，外感溫?zé)岫拘耙l(fā)三焦失司，繼而累及臟腑[16]，因此常采用清熱解毒法進(jìn)行治療[17-19]。本課題通過大鼠CLP，使得含大量菌群的腸內(nèi)容物污染腹腔，誘發(fā)彌漫性腹膜炎，導(dǎo)致廣泛的全身性、自我破壞性炎癥反應(yīng)。該膿毒血癥模型可有效模擬臨床膿毒癥患者的血液動(dòng)力學(xué)、炎癥反應(yīng)及代謝變化[20]。此外，由于氨芐青霉素鈉作為抗菌藥，在臨床膿毒血癥病情控制中發(fā)揮著重要作用[21]，也是膿毒血癥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中常用的陽(yáng)性對(duì)照藥，可通過控制細(xì)菌感染從而緩解膿毒血癥并發(fā)癥[22]，故將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥。基于黃柏為清熱燥濕、解毒療瘡的傳統(tǒng)中藥，本實(shí)驗(yàn)擬圍繞其核心成分黃柏堿展開研究，考察其治療膿毒癥AKI的作用及相關(guān)機(jī)制。

研究認(rèn)為，膿毒血癥通過調(diào)控血流動(dòng)力學(xué)、內(nèi)毒素、炎性因子、細(xì)胞凋亡及免疫抑制等因素直接參與AKI的形成[23]，而炎癥介質(zhì)的過度釋放與膿毒癥AKI的發(fā)生、發(fā)展存在直接聯(lián)系。TNF-α、IL-6及IL-1β作為標(biāo)志性炎癥介質(zhì)，在膿毒癥血清中明顯增加[24]。研究表明，TNF-α、IL-6及IL-1β可通過誘導(dǎo)腎小球中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致腎臟受損[25]。同時(shí)有證據(jù)發(fā)現(xiàn)，降低上述炎癥因子的水平可有效緩解膿毒癥AKI[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著上升，腎臟病變嚴(yán)重；通過黃柏堿干預(yù)后可有效降低大鼠血清中該類炎癥因子含量，且不同程度地緩解腎臟病變。由此提示，黃柏堿可能通過下調(diào)體內(nèi)炎癥水平，繼而達(dá)到減輕膿毒癥AKI的作用。

NGAL和KIM-1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與膿毒癥AKI診斷緊密關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物。生理?xiàng)l件下，NGAL主要在中性粒細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中低水平表達(dá)[27]，當(dāng)機(jī)體處于病理改變時(shí)其表達(dá)迅速增加。研究發(fā)現(xiàn)，缺血或腎毒性模型小鼠體內(nèi)NGAL表達(dá)增加[28]，同時(shí)亦當(dāng)作幼兒行體外循環(huán)后發(fā)生AKI的判斷依據(jù)[29]。因此NGAL可被看作為早期的、靈敏的AKI標(biāo)記物。KIM-1主要在腎臟近曲小管上皮細(xì)胞低表達(dá)，當(dāng)處于AKI時(shí)，其表達(dá)量顯著增加。KIM-1可促進(jìn)上皮細(xì)胞黏附，因此AKI改善后期表達(dá)量也逐步降低直至損傷修復(fù)[30-31]。由于KIM-1具有高度的敏感性與特異性，因此也是良好的AKI診斷指標(biāo)。同時(shí)在科研及臨床中，Cr與BUN通常是評(píng)價(jià)腎功能的金指標(biāo)，Cr可較好的反映早期腎損傷程度，而BUN可間接反映腎臟的排泄能力[32]。研究結(jié)果表明，黃柏堿可有效降低膿毒癥AKI大鼠體內(nèi)腎損傷標(biāo)志物（NGAL和KIM-1）水平，改善腎功能指標(biāo)（Cr與BUN）分泌。由此提示，黃柏堿可通過減輕腎損傷、改善腎功能，繼而在膿毒癥AKI進(jìn)程中達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。TLR4與NLRP3作為固有免疫系統(tǒng)的識(shí)別受體，廣泛分布于免疫細(xì)胞及體內(nèi)器官中。當(dāng)病原微生物感染機(jī)體后，通過分泌內(nèi)毒素激活TLR4信號(hào)通路，繼而激活下游一系列信號(hào)通路（如NF-κB通路）[33]，促進(jìn)TNF-α、IL-6及IL-1β合成與分泌，加劇炎癥反應(yīng)[34]。TLR4/NF-κB不僅參與炎癥的調(diào)節(jié)，同時(shí)也著重參與NLRP3炎癥復(fù)合體的激活[35]。已有研究表明，NLRP3炎癥復(fù)合體在AKI的病理進(jìn)程中占據(jù)關(guān)鍵角色，可同時(shí)促進(jìn)血清Cr升高，增加中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)將IL-1β前體轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β并釋放到細(xì)胞外，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[36-37]。其中NLRP3蛋白的表達(dá)則可視為炎癥復(fù)合體激活的限速靶點(diǎn)[38]。研究結(jié)果顯示，膿毒癥AKI大鼠腎組織中TLR4與NLRP3表達(dá)水平顯著增加，而黃柏堿干預(yù)后可明顯抑制TLR4與NLRP3的表達(dá)。由此提示，黃柏堿可能通過調(diào)控TLR4/NLRP3信號(hào)通路，繼而達(dá)到改善膿毒癥AKI的作用。

綜上所述，黃柏堿可有效減少膿毒癥AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌水平，從而緩解腎臟損傷的病理進(jìn)程。由于黃柏堿的腎臟保護(hù)作用，使得大鼠血清中腎損傷標(biāo)志物（NGAL和KIM-1）的表達(dá)及腎功能指標(biāo)（Cr與BUN）的分泌明顯減少，而上述作用可能與黃柏堿下調(diào)TLR4/NLRP3信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。通過本研究，明確驗(yàn)證了黃柏堿改善膿毒癥AKI的作用，深刻闡釋了其保護(hù)腎臟的機(jī)制，為膿毒癥AKI的干預(yù)提供新的方法與策略，為黃柏的研究及運(yùn)用提供新思路。