何麗紅，鄭 宣，莫佳航，許世超，方偉利，胡云根，全仁夫

黃芪多糖（astragaluspolysacharin，APS）是以黃芪干燥的根為原料提取的一種生物活性多糖，是黃芪主要的有效成分，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物具有很強(qiáng)的促血管再生作用[1]。APS對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的增殖具有促進(jìn)作用，研究發(fā)現(xiàn)APS在低濃度時可明顯促進(jìn)該細(xì)胞的增殖[2]。本實(shí)驗(yàn)研究了APS對HUVEC的細(xì)胞周期、凋亡及其對細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，并從血管內(nèi)皮新生的角度探討了使用APS治療缺血性疾病的機(jī)制，為使用APS促進(jìn)組織再生及組織血管化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC，購自上海皓歌生物科技有限公司。用含10%胎牛血清（FBS）的M200培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

1.2 藥物與試劑 APS（西安旭煌生物科技有限公司）；M200細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），VEGF（杭州紐龍生物公司），鼠抗人VEGF單抗（Abcam），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（康成生物），AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（碧云天生物），細(xì)胞周期檢測試劑盒（碧云天生物）。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo），熒光倒置顯微鏡（日本Nikon），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 對照組，0.1、1、10、50、100、200 μg/mL APS組，20 ng/mL VEGF組。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖 HUVEC經(jīng)PBS洗滌，消化，用含0.5% FBS的M200培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞記數(shù)，按每孔5×103/150 μL接種于96孔板。全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，換上只含有0.5 %FBS的培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。分別加入對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組培養(yǎng)基。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)12、24、36、48、72 h后，加入MTT溶液50 μL，使用酶標(biāo)儀按MTT法測定各孔490 nm和690 nm的吸光度(OD值)。每組設(shè)3個復(fù)孔，至少重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞周期檢測 釆用流式細(xì)胞儀檢測。HUVEC經(jīng)PBS洗滌、消化，用含0.5% FBS的M200培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔1×105/2 mL接種于6孔板。全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，換上只含有0.5% FBS的培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。分別加入2 mL對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組培養(yǎng)基。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液固定，4 ℃存放。PBS洗滌固定的細(xì)胞2次，2000 r/min離心5 min，加入PI染色液（終濃度為20 μg/mL）和RNaseA（終濃度為50 μg/mL），37 ℃避光染色30 min，上機(jī)前將細(xì)胞混勻，過200目尼龍網(wǎng)。30 min內(nèi)上機(jī)檢測。釆用美國BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測，激發(fā)波長480 nm，檢測細(xì)胞周期分布情況。應(yīng)用BD公司提供的相應(yīng)軟件程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。HUVEC經(jīng)PBS洗滌、消化，用含0.5% FBS的M200培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔1×105/2 mL接種于6孔板。全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，換上只含有0.5% FBS的培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。分別加入2 mL對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組培養(yǎng)基。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，收集1×106個各組細(xì)胞于離心管中。將細(xì)胞重懸于500 μL Buffer液中，分別加入5 μL PI和5 μL AnnexinV-FITC，室溫避光孵育30 min后混勻轉(zhuǎn)到流式管中用于檢測。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色 HUVEC經(jīng)PBS洗滌、消化，用含0.5% FBS的M200培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔1× 105/ 2 mL接種于6孔板。全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，換上只含有0.5% FBS的培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，以達(dá)到細(xì)胞同步化。分別加入2 mL對照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組培養(yǎng)基。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，PBS清洗3次。4%多聚甲酸固定細(xì)胞60 min，PBS清洗3次。滴加5%正常山羊血清封閉30 min后直接滴加兔VEGF單克隆抗體(1∶100)，常溫孵育90 min。PBS清洗3次后滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶100)，室溫避光孵育60 min。PBS清洗3次，滴加DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，室溫避光孵育10 min。PBS清洗3次，直接熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光的多少。DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，熒光顯微鏡觀察為藍(lán)色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)釆用SPSS18.0進(jìn)行處理，計(jì)量資料釆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Dunnett-t檢驗(yàn)的方法對樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果服從正態(tài)分布，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS對HUVEC細(xì)胞增殖的影響 MTT法表明，APS在一定的范圍內(nèi)（0.1～100 μg/mL）能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖，呈劑量依賴性。APS作用24、36、48、72 h后，該劑量范圍組OD值均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。72 h后作用最為明顯，100 μg/mL APS組較空白對照組細(xì)胞增殖率達(dá)158.80%，見圖1。

圖1 APS對HUVEC細(xì)胞增殖的影響

2.2 APS對HUVEC細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞周期結(jié)果表明：APS組、VEGF組均能使HUVEC細(xì)胞周期G2/M期和S期比例增加?？瞻讓φ战MG0/G1期，G2/M期和S期分別為50.67%、23.49%、10.21% 。隨著APS濃度增加，G2/M期和S期的比例增加，10 μg/mL時與空白對照組相比即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G2/M期細(xì)胞的比例在APS濃度為100 μg/mL時達(dá)到峰值，G2/M期和S期分別為 40.67%和 13.01%。VEGF組作用24 h后，G0/G1期，G2/M期和S期分別為32.87%、40.67%和15.59%，與空白對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明APS處理細(xì)胞后可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期向G2/M期轉(zhuǎn)變，見圖2。2.3 檢測細(xì)胞調(diào)亡 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率如圖3所示。APS組和VEGF組作用24 h后，對細(xì)胞凋亡有顯著作用，但隨著APS濃度的增加，并未顯著增加細(xì)胞凋亡率。這些結(jié)果表明APS對HUVEC有較低毒性作用，APS濃度增加不會顯著增加細(xì)胞毒性。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測HUVEC被相應(yīng)處理24 h后的細(xì)胞周期

圖3 流式細(xì)胞儀檢測HUVEC被相應(yīng)處理24 h后的細(xì)胞凋亡情況

2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 VEGF是HUVEC細(xì)胞特異性促增長因子，可顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞形成血管網(wǎng)[3]。如圖4所示，空白對照組HUVEC細(xì)胞僅少量表達(dá)VEGF。APS組、VEGF組均能刺激HUVEC細(xì)胞表達(dá)更多的VEGF。隨著APS濃度的增加，VEGF表達(dá)量增加，并在100 μg/mL時VEGF表達(dá)量達(dá)到頂峰，約為空白對照組表達(dá)量的50倍，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。100μg/mL APS組較空白組VEGF表達(dá)增加，比VEGF組表達(dá)量略低，是VEGF組VEGF表達(dá)量的88.9%。這些結(jié)果表明，APS可以促進(jìn)HUVEC細(xì)胞表達(dá)VEGF，這對于HUVEC細(xì)胞早期血管化尤其重要。

3 討論

諸多研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞對維持血管的正常功能以及血管新生有著重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管新生發(fā)生的最根本和最重要的環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞生長因子是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促血管化生長因子，可以特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新生內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和生存，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)血管生成，對組織再生有多種生物學(xué)功效[4-5]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)VEGF為陽性對照組。

圖4 熒光倒置顯微鏡檢測HUVEC被相應(yīng)處理24 h后的VEGF表達(dá)（×200）

黃芪，作為一種豆科黃芪屬植物，藥用其干燥根，是祖國醫(yī)學(xué)中“干溫補(bǔ)氣”的重要中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪具有多種功效。朱瑾波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪對血管生成具有重要促進(jìn)作用，推測黃芪可能通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移而發(fā)揮作用。APS是黃芪的主要活性成分之一，姜琛璐等[7]總結(jié)了APS能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，還有抗病毒、抗腫瘤、改善心肌和肝臟損傷的重要作用。李絢等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)APS具有降低血糖和保護(hù)血管的特殊作用。李悅山等[10]發(fā)現(xiàn)黃芪對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并能影響VEGF表達(dá)。劉洋等[11]發(fā)現(xiàn)APS對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。張小鴻等[12]發(fā)現(xiàn)黃芪及其有效成分可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成。樊煉等[13]學(xué)者發(fā)現(xiàn)APS能明顯促進(jìn)血管新生，其發(fā)生機(jī)制與VEGF及整合素蛋白αvβ3的表達(dá)相關(guān)。陳立新等[14]發(fā)現(xiàn)APS在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。張玉影等[15]總結(jié)了APS對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究進(jìn)展，認(rèn)為APS具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的獨(dú)特作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APS在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)HUVEC增殖的作用，促進(jìn)HUVEC細(xì)胞周期從G0/G1期向G2/M期和S期轉(zhuǎn)變，并且與劑量呈正比，在100 μg/mL時達(dá)到最高。APS作用24h后，100 μg/mL組和VEGF組G2/M期和S期分別為40.67%和13.01%以及40.67%和15.59%，而空白對照組G2/M期和S期分別為23.49%和10.21%。且24 h作用后，流式細(xì)胞凋亡檢測顯示APS并未增加HUVEC凋亡率，APS促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管化作用而不產(chǎn)生副作用。細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS作用24 h后，HUVEC的VEGF表達(dá)也與APS劑量呈正相關(guān)，100 μg/mL APS促進(jìn)HUVEC的VEGF表達(dá)明顯高于空白對照組。200μg/mL時APS作用較100 μg/mL略下降，這一現(xiàn)象可能與APS濃度為200 μg/mL時出現(xiàn)的輕微細(xì)胞毒性有關(guān)。

以上研究結(jié)果證實(shí)APS能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖，增加HUVEC細(xì)胞周期中G2/M期和S期的比例。同時APS可以上調(diào)HUVEC 中VEGF的表達(dá)，可以進(jìn)一步促進(jìn)新生血管的生成及組織血管化進(jìn)程。通過探討APS治療缺血性疾病的機(jī)制，從而為組織再生、促進(jìn)組織血管化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。