遆振宇，高小鵬，千東維，慕喜喜

原發(fā)性肝癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，約占我國全部癌癥患者數(shù)的20%，具有手術(shù)切除率低、死亡率高及治療難度大等特點。尋找有效的抗肝癌藥物是腫瘤內(nèi)科亟需開展的重大課題[1-2]。研究結(jié)果表明，腫瘤的浸潤、侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者病情惡化的主要原因之一，其中血管的新生作用是造成癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的主要因素[3-4]。由此可見，抑制腫瘤組織血管的生成對于治療惡性腫瘤具有重要意義[5]。復(fù)方黃黛片是臨床常用的抗癌藥物，盡管其主要成分丹參及雄黃可有效抑制腫瘤組織血管新生，但該藥物用于抗肝癌的研究較少，而考察其對于血管新生作用影響的研究亦未見開展[6]。為此，本研究觀察了復(fù)方黃黛片對Solt-Farber原發(fā)性肝癌大鼠的治療作用及其對肝癌組織血管新生作用的影響，期望為肝癌的新藥研發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只SD大鼠，6周齡雄性清潔級，體重180～220 g，均購自陜西中醫(yī)學(xué)院動物中心，動物許可證號SCXK（陜）2016-0098。飼養(yǎng)條件均為食物飲水不受限，常溫，55%濕度及晝夜各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行后續(xù)研究。

1.2 儀器及試劑 AS2型顯微照相系統(tǒng)（美國奧林匹斯公司）；TY-98型全自動血液分析儀（美國博大公司）；GF-5型全自動定量酶標儀（北京梅賽博公司）；QA-6型高速離心機（德國愛芬公司）。羧甲基纖維素鈉（美國天地公司，批號20160212）；一抗兔抗低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）抗體（美國天地公司，批號依次為00813312、00813972及00812412）；二抗HIF-1α、VEGF及VEGFR-2抗體（美國天地公司，批號依次為23091134、23093526及23097761）。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測所需試劑盒（武漢安得生物公司，批號分別為2016041302、2016021734及2016011023）。復(fù) 方 黃 黛 片(安徽省天康藥業(yè)有限公司，批注文號：國藥準字Z20090788)。

1.3 給藥劑量 參考相關(guān)動物與人體劑量的轉(zhuǎn)換公式[7]可知，大鼠劑量（mg/kg）= 6.25 × 成人劑量（mg/kg），其中成人體重以60 kg計。復(fù)方黃黛片中使用說明書中給藥劑量為1.35 g/60 kg，故大鼠常用劑量（mg/kg）= 1.35 g/60 kg × 6.25 =140 mg/kg。設(shè)置該劑量為中劑量組（140 mg/kg），2倍常用劑量為高劑量組（280 mg/kg）,1/2常用劑量為低劑量組（70 mg/kg）。

1.4 實驗動物分組、造模及給藥方法 將上述50只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、復(fù)方黃黛片高劑量組、復(fù)方黃黛片中劑量組及復(fù)方黃黛片低劑量組，簡稱為高、中及低劑量組。采用Solt-Farber二步法[8]對除正常組外各組大鼠進行原發(fā)性肝癌造模。第1 天，根據(jù)50 mg/kg的給藥劑量一次性腹腔注射二乙基亞硝胺（DEN）作為肝癌啟動劑。注射2周后，均以15 mg/(kg·d)的給藥劑量灌胃給予二乙酰氨基芴（2-AAF），連續(xù)灌胃7 d。第3周末，對各組大鼠進行2/3肝部分切除術(shù)，將大鼠肝左葉及中葉切除。同時種植紅色熒光蛋白所標記的骨髓干細胞于大鼠肝右葉的中心點、12點、9點、6點及3點鐘位置，每個注射位置均注射0.1 mL骨髓干細胞溶液（溶液濃度約106個細胞/mL）。注射完成后分層縫合。行肝部分切除術(shù)4 d后，采用灌胃法對高、中及低劑量組大鼠進行給藥復(fù)方黃黛片，劑量分別為280、140及70 mg/kg，連續(xù)灌胃18周。正常組及模型組大鼠僅給予等量生理鹽水。

1.5 取材方法 末次灌胃給藥12 h后，用乙醚將所有大鼠麻醉。采用腹主動脈取血法取血4 mL，在0 ℃條件下低溫離心5 min（離心半徑15 cm，3000 r/min）進行分離血清處理。采用全自動血液分析儀（CC-hj型；美國博大德生物科技有限公司）檢測其中AST、ALT及TBIL含量。取血完成后，利用頸椎脫臼法處死各組大鼠，解剖腹腔并剪取肝臟，并將其平均分為4部分，均以10%福爾馬林溶液固定。取其中一份，采用蘇木素-伊紅染色（HE染色）進行病理組織學(xué)觀察。另取3份肝臟組織，依次進行抗原修復(fù)、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、復(fù)染及封片處理，采用免疫熒光法檢測其中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2的表達情況，陽性表達呈紅色狀。利用AS2型顯微照相系統(tǒng)對其進行拍照，采用Image-proplus 6.0軟件分析各組大鼠腫瘤組織中上述蛋白的相對表達量。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。本研究的計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃黛片對大鼠血清肝功能指標的影響 本研究在造模過程中，模型組、高、中及低劑量組分別存活9只、9只、10只及9只，存活的大鼠均造模成功。與模型組比較，正常組、復(fù)方黃黛片高劑量組、復(fù)方黃黛片中劑量組及復(fù)方黃黛片低劑量組大鼠血清中ALT、AST及TBIL均明顯降低（P＜0.05）。與正常組比較，復(fù)方黃黛片高劑量組、復(fù)方黃黛片中劑量組及復(fù)方黃黛片低劑量組大鼠血清中ALT、AST及TBIL均明顯增高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指標比較

2.2 復(fù)方黃黛片對大鼠組織病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果表明，正常組肝細胞形態(tài)正常，無炎性細胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)正常且門管區(qū)清晰可見。模型組肝組織中癌細胞呈不同程度的分化，排列成巢狀，核仁突出，且異型較為明顯。復(fù)方黃黛片高劑量組、復(fù)方黃黛片中劑量組及復(fù)方黃黛片低劑量組大鼠肝組織均出現(xiàn)癌變，癌細胞呈梁狀排列，核仁較為突出，且異型較為明顯，但癌變程度均不及模型組。見圖1。

2.3 復(fù)方黃黛片對大鼠肝組織HIF-1α、VEGF及VEGFR-2表達的影響 熒光免疫組化中，HIF-1α、VEGF及VEGFR-2陽性均呈紅色分布于肝臟細胞核中，呈現(xiàn)顆粒狀分布。模型組大鼠肝組織中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2均呈強陽性表達，正常組中則僅偶見表達，而復(fù)方黃黛片高劑量組、復(fù)方黃黛片中劑量組及復(fù)方黃黛片低劑量組大鼠肝組織中則出現(xiàn)不同程度的陽性表達，且表達情況均明顯低于模型組（圖2～4）。定量分析結(jié)果表明，與模型組比較，正常組、高、中及低劑量組大鼠肝組織HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相對表達量均明顯降低（P＜0.05）。與正常組比較，高、中及低劑量組大鼠肝組織HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相對表達量均明顯增高（P＜0.05）。見表2。

圖1 各組大鼠組織病理學(xué)觀察結(jié)果

圖2 各組大鼠肝組織中HIF-1α的表達情況

圖3 各組大鼠肝組織中VEGF的表達情況

圖4 各組大鼠肝組織中VEGFR-2的表達情況

表2 各組大鼠肝組織HIF-1α、VEGF及VEGFR-2的相對表達量比較

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一，盡管隨著外科手術(shù)、放療及化療方法的不斷發(fā)展，目前肝癌的臨床治療效果已得到了較大的提升。但總的來說，該疾病的生存率仍較差，故還應(yīng)對治療方法進行更系統(tǒng)全面的優(yōu)化[9-10]。原發(fā)性肝癌是一類典型的富血管惡性腫瘤，其中新生血管的生成作用在肝癌細胞的生長與浸潤中起到重要作用。而肝癌的血管生成作用是一個極為復(fù)雜的生理及病理過程，涉及到多類型血管生成調(diào)控因子之間的相互協(xié)調(diào)[11-12]。其中VEGF是已發(fā)現(xiàn)的最重要的血管生成調(diào)控因子之一，可通過與腫瘤組織中血管內(nèi)皮細胞表面受體特異性結(jié)合而產(chǎn)生促進新生血管形成及促進內(nèi)皮細胞增殖等作用[13]。VEGFR-2則是機體中最常見的VEGF受體之一，與VEGF蛋白相互結(jié)合后可發(fā)生一系列自身磷酸化，并誘導(dǎo)多種類型調(diào)控血管生成作用的信號傳導(dǎo)，在肝癌病灶的血管生成中扮演著重要角色[14]。此外，隨著人體肝癌病灶體積的不斷增長，腫瘤細胞對內(nèi)環(huán)境中氧的需求量亦隨之增高，病灶中相對的缺氧環(huán)境可促進肝癌細胞分泌HIF-1α，而該蛋白是一種可促進VEGF合成與分泌的蛋白，從而產(chǎn)生促血管新生活性[15-16]。

復(fù)方黃黛片主要由青黛、太子參、丹參及雄黃等藥材所組成，具有益氣生血、扶正祛邪及清熱解毒等功效，臨床常用于治療急性早幼粒細胞白血病等疾病[17]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究結(jié)果顯示，復(fù)方黃黛片的主要成分丹參總生物堿、雄黃水提取物及三氧化二砷，均能夠有效抑制惡性腫瘤的新生血管作用，但關(guān)于該藥物對原發(fā)性肝癌病灶血管生成作用的研究則尚未開展[18]。鑒于復(fù)方黃黛片具有較好的抗腫瘤及抑制血管新生作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者采用復(fù)方黃黛片治療Solt-Farber原發(fā)性肝癌大鼠，期望為該藥物的臨床推廣及肝癌的治療提供一定依據(jù)。

本研究選用Solt-Farber二步法對大鼠進行原發(fā)性肝癌的造模[19]。首先利用二乙基亞硝胺攻擊肝臟，造成肝細胞大量變性壞死，促進肝臟細胞的增生作用。隨后采用2-AAF攻擊增生作用下的肝細胞，進一步發(fā)揮其致癌效果。最后，采用肝部分切除術(shù)及注射骨髓干細胞可進一步加劇肝細胞的異常增生，造成肝細胞出現(xiàn)不受控制的增殖，并最后形成肝癌細胞。該方法具有造模成功率較高、大鼠死亡率較低等優(yōu)點[20]。本研究中僅見少數(shù)大鼠死亡，且存活的所有大鼠均造模成功，進一步證實了該造模方法的可靠性。在本研究中，與模型組比較，高、中及低劑量組大鼠血清中AST、ALT及TBIL均明顯降低，而病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示高、中及低劑量組大鼠肝組織癌變程度均不及模型組，且肝組織中HIF-1α、VEGF及VEGFR-2相對表達量均明顯降低，表明復(fù)方黃黛片能夠有效改善原發(fā)性肝癌大鼠肝臟功能、緩解由于惡性腫瘤所致肝臟病理學(xué)改變、抑制HIF-1α、VEGF及VEGFR-2等血管新生作用相關(guān)蛋白的表達，對于肝癌的治療具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃黛片對Solt-Farber二步法所誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌大鼠具有較好的治療作用，其主要作用機制可能在于抑制腫瘤病灶的血管新生作用，值得進行深入研究。