喬輝，劉蔚，赫錦錦，王景春

（河南大學第一附屬醫(yī)院藥學部，河南 開封 475001）

少弱精癥是男性不育最常見的病因之一，由于其發(fā)病機制尚不清楚，因而對于少弱精癥的治療仍然處于探索階段。目前臨床常采用維生素E與其他藥物聯(lián)合治療少弱精癥[1]，取得了一定的效果，但是作用機制還不清楚。本實驗采用雷公藤多甙誘導少弱精癥的模型大鼠,系統(tǒng)地研究維生素E對大鼠精子的密度、活力、活率、直線運動速度等指標的影響,并探討維生素E治療少弱精癥的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康Sprague-Dawley大鼠，雄性，初始體質(zhì)量250～280 g，河南省實驗動物中心提供，合格證號：0000713；許可證號SCXK（豫）2005-0001。飼料、墊料均由實驗動物中心提供。在恒溫21℃～24℃，相對濕度45%～50%的環(huán)境中適應飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 藥物及試劑

雷公藤多甙片（上海復旦復華藥業(yè)有限公司，國藥準字：Z31020415，規(guī)格：10 mg/片），使用前用0.9%氯化鈉注射液稀釋成混懸液灌胃。維生素E（天津市中央藥業(yè)有限公司，國藥準字：H12020262，規(guī)格：0.1g/粒）使用前用玉米油將其溶解后灌胃。兔抗大鼠HSP70-2(美國Epitomics公司)和小鼠抗大鼠GAPDH(北京中杉金橋生物工程公司)，山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋生物工程公司)。

1.3 主要儀器

精子分析系統(tǒng)(清華同方)，Mini-Protean Ⅱ型垂直板電泳槽（BIO-RAD公司），Power-Pac 200型電泳儀（BIO-RAD公司）冷凍離心機（德國Hettich公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

28只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為四組：正常對照組、模型組、溶劑治療組和維生素E治療組，各7只。根據(jù)參考文獻，除正常對照組外，其他各組動物每日灌胃雷公藤多甙20 mg/kg，連續(xù)灌胃5周后，將正常組與模型組動物處死，取精子并檢測精子密度、活力、活率、直線運動速度，與正常組大鼠相比判斷模型是否建立成功，并取睪丸組織一小塊置于-80℃保存，備用。造模成功后，維生素E治療組每日灌胃150 mg/kg，連續(xù)給予5周，溶劑治療組每日灌服等體積的玉米油。5周后，將動物處死，檢測精子密度、活力、活率、直線運動速度以及各組HSP70-2蛋白在睪丸組織中的表達。

2.2 精子的采集及各項指標的分析

應用擴散法收集大鼠附睪尾精子，將左側(cè)附睪取尾部放入盛有2 mL37 ℃0.9%氯化鈉注射的培養(yǎng)皿中,剪開幾處切口，37℃恒溫水浴5 min，以便于精子充分游離出來，取10 μL加到預熱至37 ℃的血細胞計數(shù)板上用于精子質(zhì)量分析。采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（computer assisted sperm analysis，CASA）檢測精子的密度、活力、活率、直線運動速度。

2.3 睪丸蛋白的提取以及Western blotting

取各組動物部分睪丸組織加入100μL RIPA裂解液（普利萊公司，中國），用研磨棒勻漿，此后樣品繼續(xù)在冰上裂解1小時后12 000 g離心10 min取上清，用BCA蛋白試劑盒（Pierce 公司，美國）定量。每組蛋白取60 μg變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配置的5%脫脂奶室溫封閉1 h后孵育一抗：兔抗大鼠HSP70-2 （1∶500）和小鼠抗大鼠GAPDH（1∶1 000），4℃，過夜。第二天經(jīng)過TBST液洗滌3次后孵育二抗（1∶2 000），室溫1 h，再次經(jīng)過TBST液洗滌3次后，通過ECL試劑盒（Pierce公司，USA）發(fā)光，顯影，掃描并統(tǒng)計灰度值。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Prizm 5.0 軟件統(tǒng)計分析和處理數(shù)據(jù)，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 四組精子各項指標比較

雷公藤多甙組大鼠精子的密度、活率、活力以及直線運動速度等指標低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；維生素E治療組大鼠精子的密度、活率、活力以及直線運動速度高于溶劑治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 不同分組精子各項指標的統(tǒng)計分析

圖1 雷公藤多甙組大鼠精子的密度（A）、活率（B）、活力(C)以及直線運動速度(D)

3.2 四組HSP70-2蛋白的表達

雷公藤多苷組大鼠睪丸中HSP70-2蛋白的表達低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；維生素E治療組HSP70-2蛋白的表達高于溶劑治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 四組大鼠睪丸中HSP70-2蛋白的表達

4 討論

少弱精癥主要表現(xiàn)是精子數(shù)目減少，活力降低以及運動能力低下，是男性不育最常見的病因之一。本研究根據(jù)以往的文獻報道，采用雷公藤多甙法成功建立了少弱精癥大鼠模型，主要原理是雷公藤多甙可以干擾圓形精子細胞向精子轉(zhuǎn)化[2-3]。維生素E為一種脂溶性維生素，研究報道，維生素E聯(lián)合助育湯、維生素C、硫酸鋅能明顯改善精子的密度和活力[4]；對老年小鼠連續(xù)腹腔注射5周維生素E后，精子質(zhì)量明顯提高[5]。本研究結(jié)果顯示，維生素E治療組大鼠精子的密度、活率、活力以及直線運動速度顯著高于溶劑治療組，說明維生素E可提高精子質(zhì)量，治療少弱精癥。那么維生素E是通過何種機制來治療少弱精癥的呢？

哺乳動物精子發(fā)生是一個獨特而復雜的細胞分化過程，在該過程中，熱休克蛋白HSP70-2作為一種應激蛋白，在正常生精過程中的持續(xù)存在并且阻止生精細胞發(fā)生凋亡,從而使生精細胞完成細胞周期，促進精子的形成[6]。如果睪丸組織中HSP70-2表達下調(diào)或者不表達（例如隱睪癥患者），則生精細胞會發(fā)生凋亡，精子形成受阻，導致不育[7]。有文獻報道，維生素E可上調(diào)HSP70-2蛋白的表達，提高睪酮水平[8]。本研究結(jié)果顯示，雷公藤多甙誘導的少弱精大鼠睪丸組織中HSP70-2蛋白的表達與正常組比較明顯下調(diào)，當用維生素E治療后，HSP70-2蛋白的表達明顯上調(diào)。證實維生素E治療少弱精癥是通過上調(diào)HSP70-2來實現(xiàn)的。

綜合，維生素E可治療少弱精癥，作用機制可能是上調(diào)HSP70-2表達。