戎 光，周慶兵，李 婧，梅 俊，金 宇，徐鳳芹

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所(北京100091)；2.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院(深圳 518000)

心腦血管疾病在我國居于死亡原因的前兩位，其中冠心病及中風(fēng)的發(fā)病率和死亡率在某些地區(qū)呈上升態(tài)。兩種疾病有著相同的病理基礎(chǔ)，那就是動脈粥樣硬化，但當冠心病及中風(fēng)發(fā)作時，病變已經(jīng)到了不可逆的嚴重階段，所以早期診斷、早期干預(yù)具有重要意義。大量的證據(jù)表明動脈粥樣硬化的發(fā)生有許多危險因素，包括高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、年齡因素和飲酒等，其中被認為最直接、最重要的因素是高膽固醇血癥。多項臨床研究表明，心腦血管疾病的發(fā)生率與高膽固醇血癥的嚴重程度呈正相關(guān)。

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS) 是許多缺血性心腦血管疾病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，是一種慢性炎癥性疾病，動脈管壁上形成散在的斑塊是其主要特征，斑塊的基本成分是脂質(zhì)，單核細胞來源的巨噬細胞吞噬脂質(zhì)后成為泡沫細胞，其在AS形成及發(fā)展中占有重要地位[2]。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(Reverse cholesterol transport，RCT)是指膽固醇從外周細胞內(nèi)流出，經(jīng)血液循環(huán)轉(zhuǎn)運到肝臟細胞中進行代謝并合成膽汁排出的過程。 RCT 能有效清除細胞中多余的膽固醇，與AS的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[3]。其中ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體Al(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)、ABCG1、B 類I 型清道夫受體(Scavenger receptor class B type I，SR-BI)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferator-activated receptors-γ，PPAR-γ) 等基因在RCT過程中發(fā)揮重要作用，上述基因表達水平的高低對于AS的發(fā)展及治療均具有重要作用，也是進行抗 AS 類藥物研發(fā)的重要靶點[4]。動脈粥樣硬化是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名詞，常和高脂血癥同時存在，中醫(yī)本無動脈粥樣硬化的病名，但根據(jù)頭暈、心慌、胸悶、痞滿、健忘、肢體麻木等臨床表現(xiàn)，可歸于“痰濁”、“胸痹”、“眩暈”、“癡呆”等范疇。諸多醫(yī)家因自身認識疾病的角度和經(jīng)驗不同，從痰論治、從瘀論治、補益臟器等治法及方藥各不相同。吾師徐鳳芹教授長期從事中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病的臨床工作，曾作為陳可冀院士學(xué)術(shù)繼承人及陳可冀名醫(yī)工作室負責(zé)人，與陳院士傳承團隊一起致力于總結(jié)陳院士的學(xué)術(shù)思想尤其是活血化瘀理論及通補理論，在此學(xué)術(shù)基礎(chǔ)上，針對高脂血癥合并動脈粥樣硬化創(chuàng)新性提出:“脈濁”理論。吾師認為，此病病位在脈，病機為本虛標實，本虛即五臟及氣血陰陽的虧虛，標實即痰、瘀、熱、毒、濁等。徐鳳芹教授以“脈濁”理論為依據(jù)，以化濁通脈治法為綱創(chuàng)立的化濁通脈方是治療AS及高脂血癥的成方。化濁通脈方由虎杖、山楂、郁金等六味中藥組成，是中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院徐鳳芹教授臨床治療AS類疾病的經(jīng)驗方，能有效針對AS類疾病“濕、熱、毒、瘀、虛”的病機特點。前期筆者所在課題組的動物實驗表明，化濁通脈方能調(diào)節(jié)AS兔血脂水平，且與辛伐他汀作用相似，但是具體機制不明[5]。本實驗觀察化濁通脈方對 RAW264.7源性泡沫細胞形成過程中RCT相關(guān)主要基因的影響，從體外探索該方抗AS的分子生物學(xué)機制。

材料和方法

1 材 料

1.1 細胞培養(yǎng)：RAW264.7細胞株來源于北京協(xié)和細胞資源中心，將購得的細胞株分裝凍存，剩余RAW264.7細胞在含有10%胎牛血清的DEME高糖培養(yǎng)液中靜置于37.0℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，視細胞狀態(tài)更換培養(yǎng)液。當細胞融合成片至視野的70%～80%時，移入超凈臺；吸去培養(yǎng)瓶中殘液，每瓶加胰酶1 ml，置孵箱孵育(37℃、5%CO2)3 min；細胞全部漂浮后，每瓶加10% FBS DMEM 1 ml終止，抽吸于離心管中，1000 r/min，離心2 min，而后以1∶3的比例進行細胞傳代，平分于3個5 ml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2 化濁通脈方原液配置：化濁通脈方原液由我院制劑室配制，藥物虎杖、荷葉、決明子各15 g，金櫻子30 g，生山楂、郁金各20 g等，共1劑，以雙蒸水300 ml浸泡30 min，大火燒開后轉(zhuǎn)小火煎3 min，共得藥液200 ml(0.575 g/ml，即每毫升藥液含生藥0.575 g)，以濾紙過濾后再經(jīng)過0.22 μm濾膜殺菌，分裝保存于-20℃冰箱，使用前1 h室溫下融化。給藥前配制成不同質(zhì)量濃度(稀釋300倍：含化濁通脈方生藥1.917 mg/ml；稀釋120倍：含化濁通脈方生藥4.792 mg/ml；稀釋60倍：含化濁通脈方生藥9.583 mg/ml)的受試液?；瘽嵬}方原液以該方君藥虎杖中的大黃素和虎杖苷為質(zhì)量控制指標，經(jīng)HPLC檢測，每毫升原液中含大黃素0.326 mg，含虎杖苷0.094 mg。

1.3 實驗主要試劑:澳洲胎牛血清(Gibco公司，批號：1914970)；DMEM 高糖培養(yǎng)液(美國Hyclone，批號：AGK568431)；細胞活力檢測試劑盒(CCK-8)：(南京恩晶生物科技有限公司，批號E1CK- 00208)；氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)：(廣東奕源生物科技有限公司，批號：2018-02-13)；胰蛋白酶(南京恩晶生物科技有限公司，批號：EG20180129)；油紅O染色料、TRI試劑(美國Sigma-Aldrich公司，批號：SLB5248V)；膽固醇檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司提供，批號：E100520180228、E100620180224)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號KR107)。

1.4 主要儀器及設(shè)備：超凈工作臺(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，型號：SCB-1360)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，型號：MCO-15AC)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司，型號：Synergy H1)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司，型號：DMIRB) ；低溫離心機(德國Eppendorf公司，型號：Eppendorf centrifuge 5810R)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號：7500)。

2 實驗方法

2.1 建立泡沫細胞模型：所在課題組前期以80μg/ml

ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細胞成功建立泡沫細胞模型[6]，將RAW264.7細胞以濃度1.0×105個/ml種植于6孔板中，空白組、泡沫細胞組分別用含 10%FBS DMEM 及含80 μg/ml ox-LDL 、10%FBS DMEM培養(yǎng)液，各自培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液PBS 洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min后，吸出多聚甲醛溶液，再以 PBS 重復(fù)清洗2次后加入油紅O染色液，30 min后棄去染液，自來水洗滌3次，倒置顯微鏡下察看并拍照記錄。

2.2 CCK-8法細胞增殖抑制實驗：調(diào)整RAW264.7細胞濃度為0.5×105個/ml，在96孔板中接種，加入含ox-LDL的DEME培養(yǎng)液4 μl，加入濃度為80 μg/ml的ox-LDL，再設(shè)置3個復(fù)孔，在處理組中同時加入10 μl濃度不同的經(jīng)雙蒸水稀釋的化濁通脈方溶液，培養(yǎng)24h；從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔分別加入CCK-8試劑10 μl，放回培養(yǎng)箱中共孵育2 h后，搖床搖勻3 min；在450nm波長處，酶標儀測定其光吸收值；上述實驗重復(fù)3次。

2.3 酶法檢測降脂效應(yīng)：將試驗細胞分為4組：模型組(80 μg/ml ox-LDL)、小劑量化濁通脈方組(80 μg/ml ox-LDL+稀釋300倍原液)、中劑量化濁通脈方組(80 μg/ml ox-LDL加稀釋120倍原液)、大劑量化濁通脈方組(80 μg/ml ox-LDL加稀釋60倍原液)種植于96孔板中，孵育24 h后吸取培養(yǎng)液備用，PBS洗滌3次，裂解液裂解10 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，其后2000xg離心5 min，取上清液進行總膽固醇、游離膽固醇測定，具體按試劑盒說明書進行。

2.4 熒光實時定量PCR法檢測：細胞濃度調(diào)為1.0×105個/ml，種植于6孔板中，按照2.3方法將細胞共分為4組，培養(yǎng)處理24 h后棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，每孔加入TRI試劑1 ml，提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后-80℃保存。

引物序列：ABCA1引物：上游5’ -ACTTAGGGCACAATTCCACAAGA-3’，下游5’-CTCCTGTGGTGTTTCTGGATGA-3’；ABCG1引物：上游5’-TCACCCAGTTCTGCATCCTCTT-3’，下游5’- GCAGATGTGTCAGGACCGAGT -3’；SRBI引物：上游5’ -AACCGCAGCCTCCATTTC -3’，下游5’-CCGTTCCATTTGTCCACC- 3’；PPAR-γ引物：上游5’-AAGACCACTCGCATTCCT -3’，下游5’-CCACAGACTCGGCACTCA -3’；GAPDH引物：上游 5’- GTGTGAACGGATTTGGCCGT-3’，下游5’ GACAAGCTTCCCATTCTCGG 3’。

PCR反應(yīng)條件為95℃ 1 min模板變性，95℃ 5秒PCR循環(huán)中模板變性，60℃ 15 s退火/延伸共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH )為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算各組基因相對表達量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：利用GraphPad Prism 4軟件繪制試驗劑量-效應(yīng)曲線，利用單因素方差分析進行數(shù)據(jù)組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 泡沫細胞模型建立 油紅O染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，光鏡200倍放大?？瞻讓φ战M的 RAW264.7 細胞未見著色； 80μg/ml ox-LDL 與 RAW264.7細胞共同孵育24 h后染色，在大部分細胞內(nèi)側(cè)可見聚集大量紅色脂滴，聚集的紅色脂滴超過整個細胞周長的2/3，泡沫化明顯，符合泡沫細胞模型標準，本試驗以 80μg/ml ox-LDL 作為誘導(dǎo)泡沫細胞模型的干預(yù)濃度，見圖1。

2 化濁通脈方對RAW264.7來源泡沫細胞的增殖抑制作用 通過 CCK-8 法分析，化濁通脈方在稀釋10-80倍區(qū)間對泡沫細胞有明顯的抑制作用，提示該方對泡沫細胞有細胞毒作用。基于降低藥物對于泡沫細胞的細胞毒作用這一考慮，本實驗選取稀釋化濁通脈方原液60倍、120倍、300倍作為后續(xù)實驗濃度，見圖2。

3 化濁通脈方對泡沫細胞總膽固醇的作用 大劑量化濁通脈方能夠降低泡沫細胞內(nèi)總膽固醇量(P=0.037)；小劑量及中劑量化濁通脈方降脂效果均不明顯，n=3，(P>0.05)，見圖3。

A：空白組；B：80μg/ml ox-LDL組

左圖：不同濃度化濁通脈方對泡沫細胞作用的OD值比較(n=3)；右圖：化濁通脈方對泡沫細胞作用24h的劑量-效應(yīng)曲線

圖2 化濁通脈方對RAW264.7來源泡沫細胞抑制效應(yīng)

4 ABCA1、SR-BI、ABCG1、PPAR-γ基因表達 RT-PCR檢測顯示，化濁通脈方能夠提高 ABCA1 基因表達(P=0.044)，該方60倍稀釋后能提高 ABCA1 基因表達(P<0.05)，120倍及300稀釋能提高該基因表達(P>0.05)，見圖4A。對于 SRBI 基因，該方能夠提高該基因表達(P=0.0028)，以60倍稀釋最為明顯(P<0.05)，120倍與300倍稀釋組與模型組比較(P>0.05)，見圖4B?；瘽嵬}方對ABCG1基因表達無明顯作用(P=0.26)，見圖4C。不同濃度化濁通脈方都能降低PPAR-γ表達(P=0.0006)，見圖4D。

*：與模型組比較，P<0.05；NS ：與模型組比較，P>0.05

圖3 各組膽固醇含量比較

A：化濁通脈方對泡沫細胞ABCA1基因表達作用(n=3)；B：化濁通脈方對泡沫細胞SR-BI基因表達作用(n=3)；C：化濁通脈方對泡沫細胞ABCG1基因表達作用(n=3)；D：化濁通脈方對泡沫細胞PPAR-γ基因表達作用(n=3)。*：與模型組比較，P<0.05；NS ：與模型組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異

圖4 各組基因表達比較

討 論

脂代謝異常是引起AS發(fā)病的主要因素之一，RCT對于恢復(fù)脂代謝異常具有重要意義。組織細胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)總起來說可以分廣義和狹義兩種，廣義的RCT是指肝臟外的細胞如動脈血管平滑肌細胞和巨噬細胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運至細胞外，與血液中的高密度脂蛋白(High densityli poprotein，HDL)結(jié)合，再由HDL轉(zhuǎn)運至肝臟代謝，經(jīng)過肝腸循環(huán)后，最后變成一部分膽汁酸由糞便排出體外[7]。在這個過程中HDL參與的RCT主要分三個步驟：膽固醇從外周細胞中流出；HDL中膽固醇的酯化；HDL膽固醇酯的轉(zhuǎn)運與清除[8]。狹義的RCT僅指膽固醇從平滑肌細胞和巨噬細胞等外周細胞內(nèi)流出，從上述可知，HDL的形成和代謝貫穿了 RCT途徑抗動脈粥樣硬化的所有環(huán)節(jié)。

目前的研究表明，ABCA1、ABCG1、SR-BI以及PPAR-γ是參與細胞RCT過程的關(guān)鍵基因。細胞內(nèi)的游離膽固醇轉(zhuǎn)運到細胞外受體主要有以下3種途徑[9]：膜孔擴散、易化擴散和主動轉(zhuǎn)運，ABCA1、ABCG1介導(dǎo)了主動轉(zhuǎn)運，SR-BI介導(dǎo)了易化擴散，PPAR-γ可通過調(diào)控介導(dǎo)膽固醇流出及血漿轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達而在膽固醇代謝中發(fā)揮重要作用，其通過ABCA1、SR-BI參與RCT[10]。

ABCA1和 ABCG1介導(dǎo)游離膽固醇流出的主動轉(zhuǎn)運過程，即是ABCA1 ABCG1利用ATP提供的能量參與了膽固醇和磷脂從外周細胞內(nèi)流出。細胞內(nèi)外的脂質(zhì)平素處于一個動態(tài)平衡，ABCA1的表達可以隨著細胞內(nèi)膽固醇增多而上調(diào)，研究證實ABCA1通過啟動膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，在維持機體脂質(zhì)平衡、清除多余脂質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用[11]。ABCG1的表達增加則能夠促進游離膽固醇和磷脂流出至成熟HDL，此外ABCG1還可以使細胞膜上的游離膽固醇發(fā)生重構(gòu)，促進膜孔擴散[9]。以提高ABCA1或者ABCG1表達為目的的抗AS研究已有報告，如有學(xué)者發(fā)現(xiàn)苦瓜蛋白能夠抑制小鼠AS斑塊形成，并且能夠降低小鼠血清總膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇水平，體外實驗證實苦瓜蛋白通過顯著上調(diào)ABCA1蛋白表達實現(xiàn)抗AS效應(yīng)[12-13]。在本研究中，化濁通脈方能夠增加ABCA1基因表達，尤其以大劑量最為明顯，而對于ABCG1，化濁通脈方無明顯作用。

SR-BI介導(dǎo)了細胞內(nèi)游離膽固醇轉(zhuǎn)運到細胞外的易化擴散。SR-BI是位于細胞膜上的同源低聚糖蛋白，它能夠識別并結(jié)合HDL中載脂蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)并形成有一定功效的復(fù)合物，并能夠轉(zhuǎn)變成橫跨細胞膜內(nèi)外的疏水孔道，輔助游離膽固醇通過，從而促進了膽固醇由HDL轉(zhuǎn)運至細胞外[14]。此外，在廣義膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程中，肝臟攝取血液中膽固醇主要通過SR-BI，SR-BI選擇性攝取 HDL中的游離膽固醇及膽固醇酯，在膽固醇 7α-羥化酶等一系列酶的作用下被攝取進入肝臟的膽固醇生成膽汁酸[15]。因而SR-BI也可作為抗AS藥物研究的靶點之一，賈連群等研究發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方能夠顯著降低AS小鼠血清膽固醇、膽固醇酯以及低密度脂蛋白，其機制可能和提高肝臟SR-BI、肝臟低密度脂蛋白受體(LDL-R)、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)基因表達有關(guān)[16]。在本次研究中，我們也發(fā)現(xiàn)化濁通脈方能夠提高SR-BI基因表達，且以大劑量最為明顯，提示SR-BI基因是化濁通脈方的又一重要靶點。

PPAR-γ是一種核激素受體(Nuclear hormone recptor)，已知的PPAR受體共有3 個亞型，分別是α、β以及γ，PPAR-γ是被研究最深入的亞型，已有研究顯示PPAR激動劑能有效治療AS類疾病，但有嚴重的副作用或者致癌風(fēng)險。如PPAR-γ激動劑羅格列酮因其心血管風(fēng)險于2011年被EMA和美國FDA從市場上暫停和限用[17]，在動物實驗中吡格列酮被發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致膀胱腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)吡格列酮有誘發(fā)膀胱癌的風(fēng)險[18-19]。另一方面，最近有研究報告顯示PPAR抑制劑對于肝癌具有治療作用[20-21]。在本次研究中，大、中、小劑量化濁通脈方能夠明顯抑制PPAR-γ的表達，提示化濁通脈方抗AS效應(yīng)可能是通過提高ABCA1和SR-BI得以實現(xiàn)。

基于RCT在膽固醇代謝中的重要地位[22]，本研究結(jié)果初步證明了化濁通脈方能提高泡沫細胞中膽固醇逆轉(zhuǎn)運關(guān)鍵基因ABCA1、SR-BI的表達從而實現(xiàn)抗AS效應(yīng)。同時意外的發(fā)現(xiàn)化濁通脈方能夠抑制PPAR-γ，這顯示了本方具有復(fù)雜的作用特點。結(jié)合PPAR激動劑具有潛在致癌效應(yīng)以及PPAR抑制劑的抗腫瘤作用，我們推斷化濁通脈方可能在抗AS效應(yīng)的基礎(chǔ)上有抗癌的作用，而其具有的抑制PPAR基因表達的作用也是未來值得進一步研究的方向。