張飛，王艷秋，朱凱，張志鵬，朱振興，盧峰，鄒劍秋

不同耐鹽性高粱在鹽逆境下的比較轉(zhuǎn)錄組分析

張飛，王艷秋，朱凱，張志鵬，朱振興，盧峰，鄒劍秋

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，沈陽(yáng) 110161）

【】土壤鹽漬化是制約作物生產(chǎn)的重要非生物脅迫因子之一，高粱耐鹽性強(qiáng)，進(jìn)行高粱耐鹽基因挖掘及分子機(jī)制研究是開發(fā)和利用鹽漬土壤的有效途徑，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析與高粱耐鹽相關(guān)的基因調(diào)控機(jī)制和代謝通路，挖掘高粱耐鹽潛力。通過(guò)以篩選出的極耐鹽品種八葉齊和鹽極敏感品種PL212為試驗(yàn)材料，采用盆栽沙培，在播種后20 d（5葉期）采用180 mmol·L-1的 NaCl 溶液漫灌模擬鹽逆境，鹽脅迫48 h后取幼葉，并連同對(duì)照（未經(jīng)過(guò)鹽處理）的同期幼苗共4個(gè)樣品提取RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，采用qRT-PCR方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。耐鹽和鹽敏感材料分別在鹽漬和非鹽漬處理下的4個(gè)樣品間共檢測(cè)到1 338個(gè)差異表達(dá)基因，包括819個(gè)上調(diào)基因和519個(gè)下調(diào)基因。聚類分析發(fā)現(xiàn)在應(yīng)答鹽漬脅迫逆境時(shí)，5個(gè)依賴性氧合酶超家族蛋白、4個(gè)富含半胱氨酸的激酶、3個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和3個(gè)重金屬運(yùn)輸/解毒超家族蛋白相關(guān)基因表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)1個(gè)K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在耐鹽調(diào)節(jié)中起著重要作用。GO分析發(fā)現(xiàn)在15 418個(gè)基因中獲得4 528個(gè)有效GO注釋條目，同時(shí)耐鹽和鹽敏感材料在遭受鹽逆境時(shí)的生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面均存在較大差異。生物過(guò)程中代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程耐鹽材料明顯高于鹽敏感材料，耐鹽材料的生理過(guò)程中較鹽敏感材料增加了多生物過(guò)程和定位這兩個(gè)過(guò)程，很可能與耐鹽材料鹽抗性較強(qiáng)密切相關(guān)。差異基因KEGG分析結(jié)果顯示耐鹽和鹽敏感材料在對(duì)照和鹽漬脅迫條件下的苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個(gè)途徑中差異基因表達(dá)較多，可能是造成耐鹽和鹽敏感材料耐鹽性差異較大的重要原因。高粱耐鹽調(diào)控基因表達(dá)涉及生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能多個(gè)方面，生物過(guò)程和定位這兩個(gè)過(guò)程是提高高粱耐鹽性的關(guān)鍵；苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個(gè)途徑的基因表達(dá)很可能是造成鹽害的重要原因。

高粱；耐鹽；轉(zhuǎn)錄組；差異基因表達(dá)；生理調(diào)控

0 引言

【研究意義】土壤鹽漬化是一個(gè)全球性的資源和環(huán)境問(wèn)題，嚴(yán)重制約著作物的生產(chǎn)。中國(guó)鹽漬化土壤面積約為3 600萬(wàn)hm2，占全國(guó)可利用土地的4.88%[1]，且鹽漬化土壤面積呈逐年上升趨勢(shì)，越來(lái)越多的土地由于鹽漬化程度過(guò)高而無(wú)法利用，造成土地資源的荒廢[2]。因此，如何利用鹽漬化土地進(jìn)行作物栽培及生產(chǎn)已成為農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要需求[3-4]。高粱是公認(rèn)的耐鹽性較強(qiáng)的作物，發(fā)掘高粱耐鹽基因，研究高粱耐鹽的代謝途徑，挖掘高粱耐鹽潛力對(duì)促進(jìn)鹽漬土地高粱生產(chǎn)及鹽漬土地資源的開發(fā)利用都尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，土壤鹽漬化對(duì)作物具有多重危害，鹽脅迫會(huì)引起作物生理代謝紊亂，如光合效率下降、呼吸作用加劇、蛋白質(zhì)合成受阻、有毒物質(zhì)積累及加速衰老和死亡等[4]。在作物耐鹽基因及分子機(jī)制研究方面，學(xué)者們開展了大量研究。曾有研究表明植物的耐鹽性涉及多個(gè)基因，由多種機(jī)制協(xié)調(diào)作用[5]。也有報(bào)道指出鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)的基因涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞防御、生理代謝及細(xì)胞生長(zhǎng)等諸多方面，這些基因以不同方式協(xié)同作用抵御鹽漬逆境，如編碼與光合作用相關(guān)的基因、滲透調(diào)節(jié)基因、自由基清除酶基因和液泡區(qū)域化酶基因等[6]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和耐鹽機(jī)理研究的不斷深入，Liu等[7]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下從水稻中分離的2個(gè)水通道蛋白基和在根部的表達(dá)增強(qiáng)；此外，一些與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的基因也被發(fā)現(xiàn)與耐鹽相關(guān)，如與果聚糖、脯氨酸、糖醇、甘氨酸等生物合成相關(guān)的基因、SOS[8]；也有研究表明Zn/Cu SOD是定位于葉綠體中的超氧化物歧化酶，轉(zhuǎn)Zn/Cu SOD基因煙草在氧化脅迫下較對(duì)照植株耐鹽性有所增強(qiáng)[9]。另外，近年來(lái)，眾多學(xué)者針對(duì)植物耐鹽代謝機(jī)制開展了大量研究，其中，以生理機(jī)制研究為主，主要包括植物對(duì)鹽脅迫的感應(yīng)及信號(hào)傳導(dǎo)、Na+運(yùn)輸、鹽脅迫下的解毒途徑等幾個(gè)方面[10]。【本研究切入點(diǎn)】盡管在其他作物耐鹽基因挖掘及耐受性分子機(jī)制方面取得了一定的研究進(jìn)展，但對(duì)高粱耐鹽性的研究仍停留在形態(tài)和生理研究水平上，在高粱耐鹽基因挖掘和代謝途徑等方面研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以篩選出的對(duì)鹽脅迫反應(yīng)極端的2個(gè)典型高粱品種為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組研究分析高粱耐鹽基因表達(dá)及基因調(diào)控路徑和網(wǎng)絡(luò)，以挖掘高粱耐鹽潛力，為耐鹽品種培育和鹽堿地高效利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以篩選出的對(duì)鹽脅迫反應(yīng)極為典型的2個(gè)材料八葉齊（極耐鹽型）和PL212（極鹽敏感型）為試驗(yàn)材料。于2017年在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院（沈陽(yáng)）人工氣候室進(jìn)行，晝/夜溫度為25℃/18℃，濕度為48%，黑暗12 h/光照12 h，光照強(qiáng)度為1 085 μmol·(m2·s1)-1。試驗(yàn)采取盆栽方式，塑料盆大小為：直徑20 cm，盆深18 cm，每盆裝0.8 kg過(guò)篩細(xì)沙，其中細(xì)沙先用清水洗干凈，再用雙蒸水清洗干凈并晾干。采用稱重法對(duì)土壤水分進(jìn)行檢測(cè)，待細(xì)沙含水量為20%時(shí)開始播種，每盆6穴，每穴2株，待出苗后每盆定苗2株。

1.2 用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品的處理

播種后20 d（5葉期），分別用蒸餾水漫灌（對(duì)照，CK）和180 mmol·L-1的NaCl鹽溶液漫灌模擬鹽脅迫對(duì)八葉齊（極耐鹽型）和PL212（極鹽敏感型）進(jìn)行處理，處理時(shí)間48 h。以下分別簡(jiǎn)稱為八葉齊對(duì)照（CK- tolerant）、八葉齊鹽處理（CK-sensitive）、八葉齊鹽處理（salt-tolerant）和PL212鹽敏感（salt-sensitive）。之后提取處理和對(duì)照幼葉樣品的RNA。

RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)：采用Trizol（Invitroge）試劑提取葉片總RNA[11]，并用DNaseⅠ（TaKaRa）去除DNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA條帶初步分析；利用NanoDrop（ThermoFisher）檢測(cè)濃度等參數(shù)；利用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent）檢測(cè)RNA樣品的完整度。完整度RIN≥7.0，且挑選濃度等指標(biāo)合格者進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 Illumina測(cè)序

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托生物科技有限公司完成。簡(jiǎn)要流程如下：樣品提取總RNA后，利用帶有Oligo （dT）的磁珠富集mRNA，其后將mRNA打斷成短片段，再以片段后的mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，繼而合成cDNA第二鏈，純化并經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作，構(gòu)建好的文庫(kù)上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)處理，首先進(jìn)行測(cè)序原始數(shù)據(jù)的處理得到去除接頭等序列的clean data。而后將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對(duì)，將序列定位到高粱基因組上，過(guò)濾掉不能定位到基因組上序列，然后基于這些序列進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量的評(píng)估和基因表達(dá)量等分析。

1.5 差異基因篩選及驗(yàn)證

1.5.1 基因表達(dá)定量 首先使用Htseq軟件提取基因的read數(shù)目，利用Reads Per RPKMKilo bases per Million reads方法計(jì)算基因表達(dá)量。其公式為：

其中，total exon reads/mapps (millions)為所有read數(shù)中有百分之多少map到這個(gè)基因，除以基因長(zhǎng)度，就可以獲得基因單位長(zhǎng)度有百分之多少的total mapped read有表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的基因表達(dá)水平用值表示。

1.5.2 差異表達(dá)基因篩選 通過(guò)比較不同樣本間的數(shù)據(jù)從而篩選出差異表達(dá)基因，后續(xù)分析中的差異基因表達(dá)模式聚類分析，使用DESeq進(jìn)行差異基因分析。在差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中，將Fold Change≥2且FDR＜0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。差異倍數(shù)（fold change）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）是通過(guò)對(duì)差異顯著性值（-value）進(jìn)行校正得到的。采用了公認(rèn)的Benjamini- Hochberg校正方法對(duì)原有假設(shè)檢驗(yàn)得到的顯著性值（-value）進(jìn)行校正，并最終采用FDR作為差異表達(dá)基因篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.5.3 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析 基因注釋的數(shù)據(jù)庫(kù)包括：non-redundant（Nr）、nucleotide（Nt）、Swiss-Prot、the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、the Cluster of Orthologous Groups（COG）和GO數(shù)據(jù)庫(kù)[12]。

1.5.4 基因驗(yàn)證 選取試驗(yàn)中檢測(cè)到的8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，20 d 苗齡對(duì)鹽敏感及耐鹽品種植株進(jìn)行鹽脅迫處理48 h，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)挑選3株長(zhǎng)勢(shì)一致植株混樣進(jìn)行地上部分總RNA提取。qRT-PCR采用3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。選取EXCEL 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Student T測(cè)驗(yàn)進(jìn)行兩兩檢測(cè)差異性，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。總RNA提取如1.2所示，利用試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（大連寶生物）合成cDNA。采用primer 3.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度片段在100—300 bp。定量PCR試驗(yàn)采用羅氏定量PCR儀器LightCycler? 480II（Roche），使用SYBR Premix EX Taq試劑（大連寶生物）。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量分析

通過(guò)對(duì)耐鹽材料對(duì)照（CK-tolerant）、鹽敏感材料對(duì)照（CK-sensitive）、耐鹽材料鹽處理（Salt-tolerant）和鹽敏感材料鹽處理（Salt-sensitive）4個(gè)樣本的錄數(shù)據(jù)信息分析（表1）。過(guò)濾后4個(gè)樣品的read平均長(zhǎng)度變化幅度為147.41—147.64 bp，基因長(zhǎng)度分布規(guī)律一致，過(guò)濾后總堿基數(shù)量258.2億，占原始總堿基數(shù)量96.8%，且在4個(gè)樣品間的變幅為61.35—64.89億，較為均勻。另外，4個(gè)樣品測(cè)得數(shù)據(jù)過(guò)濾后GC含量在52.18%—53.28%，CycleQ20值均超過(guò)95%，CycleQ30值也在90%左右。4個(gè)樣品中，過(guò)濾后堿基中N的數(shù)量平均為4.37。測(cè)得的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高，數(shù)據(jù)質(zhì)量很好，利于后期數(shù)據(jù)的分析。

2.2 基因表達(dá)數(shù)量及比例分析

分別統(tǒng)計(jì)了耐鹽和鹽敏感材料在鹽脅迫和對(duì)照條件下不同值基因的數(shù)量以及基因的表達(dá)比例（表2）。共獲取83 265個(gè)基因，采用RPKM方法標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)測(cè)序深度作了歸一化，并對(duì)基因長(zhǎng)度也作了歸一化，對(duì)不同長(zhǎng)度的基因在不同測(cè)序深度下得到的基因表達(dá)水平進(jìn)行了估計(jì)。其中值大于0.1閾值基因數(shù)量達(dá)到了89.7%。在單個(gè)基因的表達(dá)方面，值大于0.1閾值的基因表達(dá)比例為92.4%，表達(dá)水平較高。另外，4個(gè)樣品測(cè)得基因的長(zhǎng)度分布規(guī)律一致，基因數(shù)目和單個(gè)所占比例均符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)，有利于對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行深度分析。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

表2 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量及比例統(tǒng)計(jì)

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

將參試的4個(gè)樣品定位到的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，對(duì)DESeq檢測(cè)的結(jié)果按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)（差異基因表達(dá)變化2倍以上且FDR＜0.01）進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)基因顯著性差異表達(dá)情況（圖1）。在4個(gè)樣品間共檢測(cè)到1 338個(gè)差異表達(dá)基因，包括819個(gè)上調(diào)基因和519個(gè)下調(diào)基因（表3）。耐鹽品種在鹽脅迫下共有184個(gè)差異表達(dá)基因，包括122個(gè)上調(diào)基因和62 個(gè)下調(diào)基因；而鹽敏感品種鹽處理下僅檢測(cè)到121個(gè)差異表達(dá)基因，鹽脅迫下差異基因數(shù)量耐鹽品種遠(yuǎn)多于鹽敏感品種。通過(guò)維恩圖（圖2）分析，發(fā)現(xiàn)只在耐鹽品種中檢測(cè)到的差異基因?yàn)?59個(gè)，而僅在鹽敏感品種中檢測(cè)到的差異基因68個(gè)，說(shuō)明鹽脅迫造成了2個(gè)材料的基因表達(dá)變化。

表3 鹽脅迫下4個(gè)高粱樣品間的差異表達(dá)基因

圖1 差異基因火山圖

圖2 鹽處理和對(duì)照（CK）下高粱品種差異基因表達(dá)維恩圖

2.4 耐鹽相關(guān)差異表達(dá)基因的功能分析

鹽脅迫條件下，高粱的耐鹽性強(qiáng)弱很大程度上取決于耐鹽材料的差異基因表達(dá)，故以4個(gè)樣品間共檢測(cè)到的1 338個(gè)差異表達(dá)基因的聚類分析結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)應(yīng)答鹽漬脅迫逆境的耐鹽材料特有的159個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋（圖3），通過(guò)差異性檢驗(yàn)和與高粱苗期耐鹽代謝基因功能的綜合分析，篩選出4類基因在耐鹽應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用，分別為5個(gè)Fe離子氧合酶超家族蛋白、4個(gè)富含半胱氨酸的類受體激酶（RLK）、3個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和3個(gè)重金屬運(yùn)輸/解毒超家族蛋白。另外，基因功能注釋發(fā)現(xiàn)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過(guò)氧化物酶超家族蛋白也發(fā)生了相應(yīng)變化。涉及具體基因信息詳見(jiàn)表4。

圖3 與鹽脅迫相關(guān)的高粱差異表達(dá)基因注釋

表4 高粱耐鹽相關(guān)基因及功能描述

2.5 鹽脅迫相關(guān)基因的GO分析

對(duì)4個(gè)樣品的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)耐鹽和鹽敏感材料在遭受鹽逆境和對(duì)照條件下的生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面存在較大差異（圖4）。GO分析結(jié)果顯示，在15 418個(gè)基因中獲得4 528個(gè)GO注釋條目（表5）。在分子功能方面，結(jié)合和催化活性基因數(shù)量耐鹽材料明顯高于鹽敏感材料。在生物過(guò)程方面代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程等方面耐鹽材料明顯高于鹽敏感材料。另外，值得注意的是耐鹽材料的較鹽敏感材料增加了多生物過(guò)程和定位這兩個(gè)參數(shù)，這也進(jìn)一步說(shuō)明了耐鹽材料其耐鹽性較強(qiáng)可能與這兩個(gè)過(guò)程相關(guān)。

圖4 高粱耐鹽基因GO分析柱狀圖

2.6 差異基因KEGG富集及代謝途徑分析

通過(guò)差異基因KEGG分析，發(fā)現(xiàn)耐鹽和鹽敏感材料在對(duì)照和鹽漬脅迫條件下各生理代謝途徑差異基因數(shù)量差別很大（圖5）。值得注意的是，在耐鹽材料中，鹽脅迫下顯著富集了細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽代謝等有關(guān)抗氧化逆境的代謝途徑。另外耐鹽材料在蔗糖代謝、光合作用、倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成等16個(gè)代謝途徑都有顯著富集。而鹽敏感材料主要集中在一些代謝途徑如苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個(gè)途徑中差異基因較多，其他路徑基因數(shù)量很少。表明鹽脅迫下抗氧化代謝途徑、光合調(diào)控途徑和糖代謝途徑等可能增加植物抗氧化和調(diào)節(jié)滲透能力，也可能是耐鹽品種具有較強(qiáng)耐鹽調(diào)節(jié)適應(yīng)的重要原因。

縱坐標(biāo)為富集的GO term，橫坐標(biāo)為該差異基因個(gè)數(shù)。不同顏色用來(lái)區(qū)分生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能

The ordinate is the enriched GO term, and the abscissa is the number of the differential genes. Different colors are used to distinguish biological processes, cellular components, and molecular functions

圖5 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖

Fig. 5 KEGG enrichment scatter plot of differential gene

2.7 應(yīng)用qRT-PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證

為確認(rèn)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取試驗(yàn)中檢測(cè)到的8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，以鹽敏感對(duì)材料對(duì)照（CK-sensitive）值為1作基準(zhǔn)進(jìn)行比較。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR分析結(jié)果比較表明賴氨酸組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sobic.007G025900）、而氧化應(yīng)激蛋白（Sobic.004G279700）、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sobic. 002G220600）、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sobic.002G201900）、液泡鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sobic.002G194600）、果膠甲酯酶抑制劑超家族蛋白（Sobic.001G323801）、磷酸鹽應(yīng)答家族蛋白（Sobic.004G229200）、果膠乙酰酯酶家族蛋白（Sobic.003G384700）8個(gè)基因的RPKM值與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)差異均不顯著，且變化趨勢(shì)基本一致，表明qRT- PCR分析結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確。

**，P＜0.01；*，P＜0.05。因差異均不顯著，故圖中未作標(biāo)注

表5 高粱耐鹽基因分布及注釋到基因

基因集群為值小于0.05注釋 Gene clusters havevalues less than 0.05 annotations

3 討論

3.1 耐鹽涉及基因

高粱耐鹽是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，耐鹽調(diào)節(jié)涉及許多相關(guān)基因的調(diào)控。本研究以極耐鹽和鹽極敏感的2個(gè)極端高粱品種為材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)到與耐鹽相關(guān)的差異基因涉及植物細(xì)胞氧化應(yīng)激、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)逆境生理調(diào)節(jié)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究與鹽逆境下甜瓜[13]、紫花苜蓿[14]、棉花[15]和番茄[16]等的調(diào)控基因表達(dá)與滲透調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)途徑相關(guān)的結(jié)果相類似，也與岳小紅等[17]對(duì)野大麥應(yīng)答鹽漬脅迫研究發(fā)現(xiàn)的候選基因的表達(dá)模式與脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)密切相關(guān)的結(jié)果相吻合。

3.2 耐鹽基因表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)在鹽應(yīng)答時(shí)5個(gè)Fe離子氧合酶超家族蛋白、4個(gè)富含半胱氨酸的類受體激酶、3個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和3個(gè)重金屬運(yùn)輸/解毒超家族蛋白相關(guān)基因表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)，另外，鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、過(guò)氧化物酶超家族蛋白也發(fā)生了相應(yīng)變化。分析可能是由于在鹽漬逆境下，高粱幼苗代謝受阻，F(xiàn)e離子氧合酶超家族蛋白變化活躍，鹽敏感材料超氧自由基活動(dòng)加劇，鹽逆境下抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂；富含半胱氨酸的類受體激酶的變化表明在鹽脅迫下蛋白質(zhì)在接受和感知信號(hào)中受影響，并影響信號(hào)傳遞。此研究結(jié)果與Hernandez等[18]研究并提出的鹽漬條件下甘藍(lán)抗氧化系統(tǒng)變化活躍的結(jié)論基本一致，同時(shí)Xu等[19]對(duì)鹽漬脅迫下水稻滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究也得出類似的結(jié)果。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)在遭遇鹽漬脅迫時(shí)，重金屬等可與細(xì)胞生物大分子重要成分發(fā)生共價(jià)結(jié)合，對(duì)機(jī)體造成損害。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可與其結(jié)合后，可防止發(fā)生此種共價(jià)結(jié)合，起到解毒作用。重金屬運(yùn)輸/解毒超家族蛋白相關(guān)基因的變化也進(jìn)一步解釋了這個(gè)論斷。綜合分析這幾類基因主要集中在抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)和離子化轉(zhuǎn)運(yùn)生理過(guò)程，同時(shí)鹽漬環(huán)境下重金屬毒害相關(guān)基因變化活躍，有可能是在成鹽害的重要原因，但耐鹽調(diào)控與重金屬運(yùn)輸和解毒機(jī)制緊密相關(guān)方面前人尚未見(jiàn)報(bào)道。

3.3 耐鹽表達(dá)基因功能

鹽脅迫下耐鹽和鹽敏感材料在遭受鹽逆境時(shí)的生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面均存在較大差異。GO分析發(fā)現(xiàn)生物過(guò)程中代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程耐鹽材料明顯高于鹽敏感材料，耐鹽材料的生理過(guò)程中較鹽敏感材料增加了多生物過(guò)程和定位這兩個(gè)過(guò)程。此類研究在鹽逆境下陸地棉[20]、紫花苜蓿[21]、棉花[22]和番茄[23]上也曾對(duì)進(jìn)行過(guò)報(bào)道，另外Wambua等[24]和Netondo等[25]對(duì)鹽漬條件下高粱的生理表現(xiàn)分析結(jié)果與本研究結(jié)論也基本一致。本研究中還發(fā)現(xiàn)在分子功能方面，結(jié)合和催化活性差異表達(dá)基因數(shù)量較多，同時(shí)多生物過(guò)程和定位這兩個(gè)過(guò)程與耐鹽調(diào)控這關(guān)系密切。本研究結(jié)果與前人指出的植物分子功能及基因表達(dá)是造成耐鹽性差異的主要原因的結(jié)論相吻合[26-27]。

3.4 耐鹽基因代謝途徑

鹽脅迫下，耐鹽和鹽敏感高粱代謝通路有所不同。本研究KEGG分析結(jié)果顯示耐鹽和鹽敏感材料在對(duì)照和鹽漬脅迫條件下在苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個(gè)途徑中差異基因較多，可能是造成兩個(gè)材料鹽耐鹽性差異的重要原因。目前，苯丙氨酸和類黃酮生物合成途徑與耐鹽性相關(guān)已有研究得出類似結(jié)論[17]，但關(guān)于類黃酮生物合成途徑在耐鹽調(diào)節(jié)中尚未見(jiàn)報(bào)道，是否是高粱耐鹽特有代謝途徑還有待于進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究結(jié)果與白子彧等[28]研究的非生物脅迫下Na+的運(yùn)輸通道和路徑與苯丙氨酸代謝密切相關(guān)的結(jié)論相吻合，同時(shí)，也有報(bào)道指出Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)Na+的運(yùn)輸途徑存在影響，且其在不同作物和生育時(shí)期存在差異[29-31]。此外，有學(xué)者指出Na+運(yùn)輸途徑不同將造成光合系統(tǒng)發(fā)生變化，影響光合物質(zhì)生產(chǎn)[13]。

4 結(jié)論

高粱耐鹽調(diào)控過(guò)程較為復(fù)雜，耐鹽調(diào)控基因涉及生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面，其中多生物過(guò)程和定位這兩個(gè)過(guò)程對(duì)高粱的耐鹽調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用；重金屬運(yùn)輸和解毒相關(guān)基因在鹽脅迫時(shí)變化活躍，可能與耐鹽調(diào)節(jié)相關(guān)；在生理代謝途徑方面，鹽敏感材料苯丙烷類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成3個(gè)途徑過(guò)量表達(dá)很可能是造成鹽害的重要原因。

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Comparative transcriptome analysis of different salt tolerance sorghum (L. Moench) under salt stress

ZHANG Fei, WANG YanQiu, ZHU Kai, ZHANG ZhiPeng, ZHU ZhenXing, LU Feng, ZOU JianQiu

(Sorghum Institute, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang 110161)

Soil salinization is one of the important abiotic stress factors that restricts crop production. Understanding the salt-tolerant mechanism of sorghum may provide a novel avenue to utilize saline soil for sorghum production. The objective of this study was to explore gene regulation mechanisms and metabolic pathways that related to salt tolerance of sorghum by transcriptome sequencing.The salt-tolerant genotype Bayeqi and salt-sensitive genotype PL212 were planted in plastic pots. At five-leaf stage (20 days after sowing), plants were treated with 180 mmol L-1NaCl. Forty-eight hours after treatment, leaves treated by NaCl and unstressed control were sampled and were used for RNA extraction and transcriptome sequencing. Sequencing results were verified by qRT-PCR.Results showed that a total of 1 338 deferentially expressed genes, including 819 up-regulated and 519 down-regulated genes were detected. Cluster analysis revealed that in response to salt stress, five dependent oxygenase superfamily proteins, four cysteine-rich RLKs, three Glutathione S-transferase and three heavy metal transport/detoxification superfamily protein-related genes were significant up–regulated and/or down-regulated, and one K+ion transporter gene was also found to play an important role in salt-tolerance regulation. GO analysis found that 4 528 valid GO annotation entries were obtained from 15 418 genes, and salt-tolerant and salt-sensitive materials showed significant difference in biological processes, cellular components and molecular functions under salt stress treatment. The salt-tolerant materials exhibited obviously higher metabolic processes and cellular processes than salt-sensitive materials. Compared with salt-sensitive materials, multiple biological processes and localization processes were increased in salt-tolerant genotype, which might be the reasons of salt-tolerance. KEGG analysis showed that the salt-tolerant and salt-sensitive materials had more differential gene expression in phenylpropanoid biosynthesis, phenylalanine metabolism and flavonoid biosynthesis under control and salt stress conditions, which may be an important reason for the weak salt tolerance of sensitive materials.The expression of salt-tolerant genes in sorghum is involved in many aspects of biological processes, cellular components and molecular functions. The gene expression in multiple processes and localization processes contributes to the salt tolerance, while excessive gene expression in phenylpropanoid biosynthesis, phenylalanine metabolism, and flavonoid biosynthesis likely contributes to the damage under salt stress.

sorghum; salt tolerance; transcriptome; differential gene expression; physiological regulation

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.006

2019-06-14；

2019-08-12

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-06-13.5-A11,CARS-06-13.5-A22）、遼寧省自然科學(xué)基金（2019-MS-197）

張飛，Tel：024-31029903；E-mail：zhangfei19821121@163.com。通信作者鄒劍秋，E-mail：jianqiuzou@126.com。盧峰，E-mail：lufeng740202023@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）