袁雨豪，楊清華，黨科，楊璞，高金鋒，高小麗，王鵬科，陸平，劉敏軒，馮佰利

糜子資源耐鹽性評價與鹽脅迫生理響應(yīng)

袁雨豪1，楊清華1，黨科1，楊璞1，高金鋒1，高小麗1，王鵬科1，陸平2，劉敏軒2，馮佰利1

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

【】評價糜子資源對鹽脅迫的耐受性，探究鹽脅迫下不同耐鹽性糜子品種形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及生理響應(yīng)，建立糜子耐鹽性鑒定的指標(biāo)體系。在人工氣候箱內(nèi)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl溶液脅迫，對100份糜子資源萌發(fā)期發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚芽鞘長、根長、芽長、根重、芽重及苗期生理指標(biāo)進(jìn)行測定。運用相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析及苗期對鹽脅迫的生理響應(yīng)進(jìn)行綜合評價，評估糜子品種對鹽脅迫的耐受性。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl脅迫處理下，糜子品種萌發(fā)期幼苗芽長小于對照，但不同品種降低幅度存在顯著差異。相關(guān)性分析表明，各萌發(fā)期指標(biāo)相對值之間存在顯著或極顯著正相關(guān)，與相對鹽害率存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。主成分分析結(jié)果表明，根鮮重、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率在萌發(fā)因子中的負(fù)荷量較大，可作為萌發(fā)期糜子耐鹽性篩選的主要鑒定指標(biāo)。聚類分析表明，伊選大紅糜、污咀黍、白黍等11個品種為高度耐鹽品種資源，呼盟黑粘糜、小黑黍、臨河雙粒黍、陜78等4個品種為高度鹽敏感品種資源。耐鹽性品種與鹽敏感性品種在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)上存在較大差異。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫時間的延長，耐鹽性品種葉表面出現(xiàn)鹽囊泡并增多變大，氣孔張開度變化不明顯。鹽敏感性品種氣孔關(guān)閉，葉片表面蠟質(zhì)增多粗糙，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞受損破裂出現(xiàn)凋亡。透射電鏡顯示，隨著鹽脅迫時間的增加，耐鹽性品種葉綠體外部形態(tài)變化不明顯，在脅迫12 h后仍能維持正常的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。而鹽敏感性品種葉綠體由橢球形或橢球形變成球形且淀粉粒增多，葉綠體外被膜逐漸解體，基粒排列紊亂隨機分布，類囊體膨脹，甚至解體消失。耐鹽性品種相對電導(dǎo)率增加幅度小于鹽敏感性品種，而葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、Y(Ⅱ)和NPQ）降低幅度小于鹽敏感性品種。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl溶液可作為糜子萌發(fā)期耐鹽性鑒定的適宜鹽濃度。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)可作為糜子萌發(fā)期耐鹽性鑒定的指標(biāo)，掃描電鏡下氣孔的狀態(tài)、透射電鏡下葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化可作為糜子耐鹽性鑒定的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)，相對電導(dǎo)率和葉綠素參數(shù)可作為糜子耐鹽性鑒定的生理指標(biāo)。

糜子；NaCl脅迫；耐鹽性鑒定；耐鹽生理響應(yīng)

0 引言

【研究意義】鹽堿化是土壤退化的主要原因之一，在世界范圍內(nèi)鹽漬化土壤面積逐年增加[1-2]，尤其是農(nóng)業(yè)用地[3-4]。目前，全球超過8億公頃的土地存在不同程度的鹽漬化，而中國約1億公頃的土地鹽漬化，主要分布在降雨量較少、蒸發(fā)量較大的長江以北干旱、半干旱地區(qū)以及東部濱海地區(qū)[5-7]。隨著全球氣候變化和不合理灌溉，干旱、半干旱地區(qū)和灌溉土地的鹽漬化程度進(jìn)一步加劇[8]。作物生長發(fā)育及產(chǎn)量受非生物脅迫的影響，尤其是高鹽度、干旱、寒冷和高溫的影響較大[9]。鹽脅迫主要通過滲透脅迫和離子毒害擾亂作物正常的生理代謝，進(jìn)而抑制作物的生長發(fā)育，導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低[10-11]。作物耐鹽性是多個發(fā)育時期、多個耐鹽性狀的綜合反映，不同作物對鹽脅迫的響應(yīng)差異很大，同種作物不同品種間耐鹽性也存在較大的差異[12-13]。因此，加強作物種質(zhì)資源耐鹽性評價、篩選出耐鹽性材料、研究作物對鹽脅迫的反應(yīng)機理對改善和利用鹽漬化土壤及提高作物的耐鹽性具有重要意義。糜子（L.）是C4植物，對營養(yǎng)和水分要求較低，能忍受鹽堿、干旱、高溫等極端條件[14]。中國糜子種質(zhì)資源豐富，尤其是地方品種資源較多，具有豐富的抗逆基因，存在廣泛的遺傳變異。因此，開展糜子資源耐鹽性評價及鑒定，挖掘耐鹽性關(guān)鍵基因，可為耐鹽性育種等相關(guān)研究提供優(yōu)異資源材料[15-17]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤鹽漬化嚴(yán)重限制作物的種植面積，抑制作物的生長發(fā)育、破壞作物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及影響正常的生理代謝[18]。小麥、玉米、水稻、棉花、甘薯等作物耐鹽性研究較多，已在耐鹽性品種鑒定、鹽脅迫生理響應(yīng)及耐鹽基因的克隆與功能分析等方面取得進(jìn)展[19-23]。盡管糜子是公認(rèn)的耐鹽性作物，但對其研究相對遲緩，萌發(fā)期及苗期耐鹽性全面系統(tǒng)的評價較少。目前糜子耐鹽性研究僅從單個品種或者幾個品種的萌發(fā)指標(biāo)和苗期鹽脅迫生理響應(yīng)進(jìn)行評價。李占成等[24]僅從萌發(fā)期利用3種鹽溶液對晉黍9號脅迫的比較分析，發(fā)現(xiàn)晉黍9號對不同種類鹽脅迫的忍耐濃度及抑制作用不同。Liu等[25]從芽、苗期對鹽脅迫的評價，認(rèn)為鹽害指數(shù)、幼苗成活率、地上部Na+濃度及高Na+/K+比可作為鑒定糜子耐鹽性鑒定的指標(biāo)。為實現(xiàn)鹽堿地有效利用和改良，提高糜子產(chǎn)量、擴(kuò)大種植面積及挖掘耐鹽性相關(guān)基因，尤其是糜子基因組的公布[26-27]，進(jìn)一步推動了糜子耐鹽性評價鑒定，為后續(xù)糜子耐鹽性基因挖掘提供材料。【本研究切入點】目前，有關(guān)糜子耐鹽性評價系統(tǒng)不完善，篩選出的糜子耐鹽性資源較少。篩選和評價糜子耐鹽性種質(zhì)資源，挖掘糜子耐鹽基因?qū)φJ(rèn)識其耐鹽性及鹽漬化土壤的有效利用、改良具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在鹽脅迫下，對糜子資源耐鹽性進(jìn)行鑒定和評價，以期找出糜子萌發(fā)期和苗期耐鹽性的主要耐鹽鑒定指標(biāo)，并篩選出耐鹽性較強的糜子資源，為后續(xù)耐鹽性基因的克隆及功能驗證提供材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗選用100個糜子品種資源，包括88個地方種和12個育成品種，品種資源名稱、來源及類型見電子附表1。

1.2 萌發(fā)期耐鹽性試驗方法

試驗于2018年采用人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)皿培養(yǎng)。挑選大小一致、顏色均一、籽粒飽滿的種子，用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，蒸餾水沖洗3次，將種子表面水分吸干，置于鋪好雙層濾紙直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中等間距擺放30粒種子，晝夜溫度為25℃，濕度為80%，光照12 h/黑暗12 h，光照強度為24 000 lx。為確定萌發(fā)期耐鹽性鑒定篩選的適宜濃度，隨機選取3份材料，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0（CK）、0.5%、1%、1.5%的NaCl溶液進(jìn)行預(yù)試驗，測定發(fā)芽勢（germination energy，GE）、發(fā)芽率（germination percentage，GP）、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）、芽長（sprout length，SL）、根長（root length，RL）、芽鮮重（shoot fresh weight，SFW）、根鮮重（root fresh weight，RFW）、活力指數(shù)（vitality index，VI）及鹽害率（salt damage rate，SDR）等9個評價指標(biāo)，經(jīng)分析確定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% NaCl溶液為糜子資源萌發(fā)期耐鹽性評價和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)濃度（圖1）。以蒸餾水為對照，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% NaCl溶液處理進(jìn)行萌發(fā)期試驗，對照與處理均設(shè)置3次重復(fù)，每個培養(yǎng)皿擺放30粒種子，加入8 ml蒸餾水或NaCl溶液，等間距擺放好種子后放置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4天開始統(tǒng)計每天發(fā)芽個數(shù)（以種子胚芽長度大于等于種子長的1/2，胚根大于等于種子長度種子為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)），第10天每培養(yǎng)皿隨機選取3株測定胚芽鞘長、芽長、根長、芽鮮重、根鮮重等。

圖1 不同鹽濃度脅迫糜子的萌發(fā)情況

萌發(fā)期生長指標(biāo)如下：

發(fā)芽勢（%）=第4天發(fā)芽種子個數(shù)/供試種子個數(shù)×100；

發(fā)芽率（%）=第10天發(fā)芽種子個數(shù)/供試種子個數(shù)×100；

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt），Gt為第t日的發(fā)芽種子個數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)（VI）=發(fā)芽指數(shù)（GI）×胚根鮮重；

根長（RL）：處理第10天，用游標(biāo)卡尺測定從種子胚到最長根尖的長度；

芽長（SL）：處理第10天，用游標(biāo)卡尺定從種子胚到最長葉尖的長度；

發(fā)芽相對鹽害率（%）=（對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率）/對照發(fā)芽率×100；

相對值=各指標(biāo)處理值/對照值。

1.3 苗期耐鹽性試驗方法

基于萌發(fā)期耐鹽性鑒定結(jié)果，選用鹽脅迫下萌發(fā)期顯著差異的2個糜子資源（高度耐鹽性和高度鹽敏感）進(jìn)行苗期耐鹽性試驗。挑選大小一致、籽粒飽滿、顏色一致的種子，用去離子水沖洗1次，0.1%的HgCl2溶液消毒 10 min，去離子水沖洗3次。置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中催芽，催芽2 d后，挑選大小一致的幼芽種植于育苗棉上放置于塑料容器內(nèi)（12.4 cm×17.5 cm×13.5 cm），加入8 L蒸餾水培養(yǎng)至一葉一心時，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，每2天更換一次。培養(yǎng)至三葉一心期時開始用含NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）的營養(yǎng)液進(jìn)行脅迫處理，以不加NaCl營養(yǎng)液作為對照，每2天更換相應(yīng)的營養(yǎng)液。脅迫0 h、12 h、1 d、3 d后進(jìn)行檢測并取樣測定生理指標(biāo)。人工生長箱晝夜溫度為30℃/18℃，濕度60%，光照14 h/黑暗10 h，光照強度為24 000 lx。

1.3.1 苗期電鏡形態(tài)結(jié)構(gòu) 將戊二醛溶液固定后的葉片經(jīng)漂洗、脫水、干燥后，分別用用場發(fā)射掃描電子顯微鏡日立S-4800和透射電鏡HITACHI HT7700觀察并拍照。

1.3.2 苗期相對電導(dǎo)率 用打孔器（直徑0.5 cm）在葉片中部取10個圓片，放入潔凈帶有刻度試管中，加入10 ml去離子水浸沒葉片，室溫靜置2 h，用電導(dǎo)率儀（DDS-307A）測定電導(dǎo)率（electrical conductivity，EC）EC1，然后置于沸水浴中10 min，冷卻至室溫測定電導(dǎo)率值EC2。根據(jù)以下公式計算細(xì)胞膜的相對電導(dǎo)率：

相對電導(dǎo)率（%）=EC1/EC2×100%

1.3.3 苗期葉綠素?zé)晒鈪?shù) 用便攜式調(diào)制葉綠素 熒光儀Mini-PAM-II（WALZ，德國），在葉片暗適應(yīng)30 min后，測定初始最小熒光F0，最大熒光Fm，以及最大光量子產(chǎn)量Fv/Fm。然后在光適應(yīng)30 min后，測定實際光能轉(zhuǎn)化效率Y(Ⅱ)、非光化學(xué)淬滅（non- photochemical quenching coefficient，NPQ）等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計分析，用SPSS 23.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析、聚類分析，用OriginPro 2019進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 萌發(fā)期耐鹽性評價

2.1.1 糜子資源萌發(fā)期對鹽脅迫的響應(yīng) 在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl溶液脅迫下，100份糜子品種資源萌發(fā)期各測量指標(biāo)相對值幾乎都小于1（電子附表2），相對發(fā)芽勢為7.4%—98.7%，相對發(fā)芽率為40.7%—102.3%，相對發(fā)芽指數(shù)為26.8%—109.9%，相對芽長為8.6%—95.6%，相對根長為2.4%—77.1%，相對芽鮮重為14.5%—99.6%，相對根鮮重為0—63.6%，相對活力指數(shù)為0—58.3%，發(fā)芽相對鹽害率為9.9%—73.2%。其中，相對根長、相對根鮮重、相對活力指數(shù)及相對鹽害率表現(xiàn)出極大差異性，變異系數(shù)分別為62.5%、74.9%、81.1%和90.8%。從電子附表2也可以看出，不同品種降低幅度存在明顯差異，說明糜子不同品種資源的耐鹽性不同，鹽脅迫下可以鑒定篩選出更耐鹽的品種資源。

2.1.2 鹽脅迫下糜子萌發(fā)期測量指標(biāo)相對值的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析表明（表1），相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對芽長、相對根鮮重、相對活力指數(shù)等5個指標(biāo)間均呈極顯著正相關(guān)（<0.01）。相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)、相對芽長、相對根長、相對芽鮮重、相對根鮮重、相對活力指數(shù)均與相對鹽害率呈負(fù)相關(guān)，且除相對根長外，均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（<0.01）。相對發(fā)芽率與相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)與相對根鮮重之間的相對系數(shù)均大于0.90，表明鹽脅迫下糜子的相對發(fā)芽率與相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)與相對根鮮重之間受到脅迫的程度相互關(guān)聯(lián)。

2.1.3 鹽脅迫下糜子萌發(fā)期測量指標(biāo)相對值的主成分分析 從糜子萌發(fā)期9個測量指標(biāo)相對值及其相關(guān)性分析來看，不同糜子萌發(fā)期9個測量指標(biāo)相對值對鹽脅迫響應(yīng)比較分散，且這9個測量指標(biāo)存在著顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系。利用主成分分析將各測量指標(biāo)相對值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，排除作用較小干擾較大的因素，提高測量數(shù)據(jù)分析精確度，對各糜子品種資源耐鹽性進(jìn)行綜合評價（表2），第Ⅰ主成分的貢獻(xiàn)率為49.98%，第Ⅱ主成分的貢獻(xiàn)率為22.31%，第Ⅲ主成分的貢獻(xiàn)率為9.90%，這3個主成分的累計貢獻(xiàn)率達(dá)82.19%，且特征值均大于1，表明前3個主成分足以反映出9個測量指標(biāo)的變化趨勢，故將這3個主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。這3個主成分與9個耐鹽性狀的相關(guān)系數(shù)（即因子負(fù)荷量），反映它們之間的相關(guān)性（表3）。第Ⅰ主成分可解釋9個耐鹽指標(biāo)的49.98%，主要與發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢有較大的正相關(guān)關(guān)系，表明鹽脅迫下，糜子發(fā)芽指標(biāo)可作為評價和鑒定耐鹽性的重要指標(biāo)。第Ⅱ主成分與芽長、芽鮮重具有較大的正相關(guān)關(guān)系，主要反映鹽脅迫下葉部生長狀況。第Ⅲ主成分與根長具有較高的正相關(guān)關(guān)系，表明鹽脅迫下，第Ⅲ主成分由根部性狀決定。

表1 萌發(fā)期鹽脅迫下各性狀相對值的相關(guān)系數(shù)

GE：發(fā)芽勢；GP：發(fā)芽率；GI：發(fā)芽指數(shù)；SL：芽長；RL：根長；SFW：芽鮮重；RFW：根鮮重；VI：活力指數(shù)；SDR：鹽害率。*：在0.05水平差異顯著；**：在0.01水平差異極顯著。下同

GE: germination energy; GP: germination percentage; GI: germination index; SL: sprout length; RL: root length; SFW: shoot fresh weight; RFW: root fresh weight; VI: vitality index; SDR: salt damage rate. *: Significant different at 5% level; **: Significant different at 1% level. The same as below

表2 3個主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率

表3 各因子載荷矩陣

2.1.4 萌發(fā)期糜子耐鹽性綜合分析 根據(jù)表4中3個主成分得分系數(shù)矩陣，以各因子的得分公式，計算出總值，將100份糜子品種的耐鹽性排序，并進(jìn)行聚類分析（表5、電子附表3）。將100份糜子品種資源分為四大類（電子附圖1）。第1類為高度耐鹽品種，包含伊選大紅糜、污咀黍、白黍等11個品種，占供試品種的11%，各個測量指標(biāo)相對值均較高。第2類包括B75-5、巴林左疙塔黍、紅糜等71個品種，占供試品種的71%，屬于耐鹽品種，各個測量指標(biāo)相對值較大。第3類包括東鄉(xiāng)朵麻糜、黃旗糜子、準(zhǔn)旗醬黃黍等14個品種，占供試品種的14%，各個測量指標(biāo)相對值較小，屬于鹽敏感品種。第4類包括呼盟黑粘糜、小黑黍、臨河雙粒黍、陜78等4個品種，占供試品種的4%，各個測量指標(biāo)的相對值都很小，屬于高度鹽敏感品種。

2.2 苗期耐鹽性評價

2.2.1 糜子苗期對鹽脅迫的響應(yīng) 在鹽脅迫下，糜子的生長明顯受到抑制（圖2）?；咳~片隨著脅迫時間的延長出現(xiàn)斑點逐漸變黃。耐鹽性糜子資源伊選大紅糜在脅迫3 d后基部第一片葉逐漸變黃，而鹽敏感糜子資源陜78在脅迫處理后，基部第一片出現(xiàn)斑點，脅迫12 h后，基部第一片葉變黃且表現(xiàn)失水，脅迫1 d后，基部第二片葉逐漸變黃失水，第四片葉頂端失水卷曲。脅迫3 d后，基部的兩片葉完全失綠變黃。

圖2 鹽脅迫下陜78和伊選大紅糜的生長情況

表4 成分得分系數(shù)矩陣

表5 高度耐鹽糜子品種資源的耐鹽性排序

2.2.2 鹽脅迫對糜子葉片表面特征的影響 掃描電鏡觀察結(jié)果表明（圖3），隨著鹽脅迫時間的增長，糜子葉片出現(xiàn)氣孔關(guān)閉，蠟質(zhì)增多，這些特征有利于植物減少水分蒸騰散失，降低植物體內(nèi)離子濃度，使植物適應(yīng)大量Na+引起的滲透脅迫和離子毒害脅迫。未脅迫條件下，兩糜子資源表皮細(xì)胞由形狀規(guī)則的長、短型細(xì)胞順著葉脈方向成行排列，這些長、短型細(xì)胞在葉表面形成凸凹不平的溝和脊，在脊的兩側(cè)有排列整齊的氣孔帶，氣孔由2個腎形副衛(wèi)細(xì)胞和2個啞鈴形保衛(wèi)細(xì)胞組成，飽滿呈橢圓形且微張（圖3-A、圖3-F）。在整個脅迫過程中，耐鹽性糜子資源伊選大紅糜細(xì)胞和氣孔變化不明顯，但葉表面脅迫后出現(xiàn)少量鹽囊泡，隨著脅迫時間的延長，鹽囊泡增多變大，順著表皮毛脫落，將體內(nèi)過多的鹽分泌出去，降低鹽分傷害（圖3-G、圖3-H、圖3-I）。而鹽敏感糜子資源陜78在脅迫后氣孔關(guān)閉且蠟質(zhì)增多不光滑，在脅迫1 d后，保衛(wèi)細(xì)胞變癟，副衛(wèi)細(xì)胞相對飽滿，脅迫3 d后，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞嚴(yán)重空癟，副衛(wèi)細(xì)胞受損破裂出現(xiàn)凋亡（圖3-B、圖3-C、圖3-E）。

2.2.3 鹽脅迫對糜子葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響 在植物光合作用過程中葉綠體起著重要的作用，未脅迫條件下，葉綠體附著在細(xì)胞壁上，整齊排列在一個方向上，外部形態(tài)呈典型的橢圓形或橢球形，其內(nèi)部類囊體排列整齊、光滑，堆疊成基粒?；|(zhì)包含淀粉粒和大量的塑性球蛋白（圖4-A、圖4-E）。在鹽脅迫后，葉綠體長度減小寬度增加，近似圓形、空泡化，基粒排列不整齊，多數(shù)基粒片層溶解，膜系統(tǒng)受損。在整個脅迫過程中，耐鹽性伊選大紅糜葉綠體外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化不明顯，邊緣清晰。而鹽敏感糜子資源陜78在脅迫開始后，逐漸解體消失，基粒片層出現(xiàn)排列不整齊。脅迫1 d后，鹽敏感糜子資源陜78葉綠體外膜基本消失，基粒排列紊亂隨機分布，類囊體膨大。脅迫3 d后，鹽敏感糜子資源陜78葉綠體出現(xiàn)明顯的腫脹由橢圓形或橢球形變成球形，葉綠體內(nèi)、外膜逐漸解體，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂嚴(yán)重受到破壞，甚至解體消失（圖4-B—圖4-D、圖4-F—圖4-H）。

圖3 鹽脅迫下葉表面的掃描電鏡圖

2.2.4 鹽脅迫對糜子苗期生理指標(biāo)的影響 如圖5-A所示，隨著鹽脅迫時間的延長，糜子葉片相對電導(dǎo)率逐漸增大，其中鹽敏感糜子資源陜78相對電導(dǎo)率的增加幅度明顯高于耐鹽性糜子資源伊選大紅糜，尤其在脅迫12 h時表現(xiàn)更為明顯。而耐鹽性糜子資源伊選大紅糜相對電導(dǎo)率增加的幅度相對緩慢。表明在鹽脅迫下，耐鹽性糜子資源伊選大紅糜細(xì)胞膜受傷害程度小于鹽敏感糜子資源陜78。

在鹽脅迫下，糜子Fv/Fm均呈現(xiàn)出下降的趨勢，并隨著鹽脅迫時間的延長下降幅度增加（圖5-B）。其中鹽敏感陜78在脅迫1 d后，F(xiàn)v/Fm急劇下降，降幅為10%，而耐鹽性糜子資源伊選大紅糜僅下降1.2%，明顯低于鹽敏感糜子資源陜78。表明鹽脅迫下，鹽敏感糜子資源陜78的PSII 反應(yīng)中心的電子傳遞能力明顯低于耐鹽性糜子資源伊選大紅糜。鹽脅迫下，糜子實際光能轉(zhuǎn)化效率Y(Ⅱ)也表現(xiàn)出下降趨勢（圖5-C），在整個脅迫過程中，耐鹽性糜子資源伊選大紅糜下降幅度較小（3.9%、6%和1%），而鹽敏感糜子資源陜78下降幅度較大（7.2%、4%和21.9%），尤其在脅迫1 d后，鹽敏感糜子資源陜78顯著低于對照，表明鹽脅迫影響葉片的光能轉(zhuǎn)化，且對鹽敏感糜子資源陜78的影響較大。鹽脅迫時間的延長可導(dǎo)致植物葉片受到傷害，甚至超過植株的承受能力，使得植株不能將過量的光能以熱能的方式耗散。隨著鹽脅迫時間的延長，鹽敏感糜子資源陜78的NPQ呈下降趨勢，NPQ在1 d后顯著下降，與對照相比下降30.6%，而耐鹽性糜子資源伊選大紅糜呈現(xiàn)出先上升后下降再上升，與對照相比變化不明顯（圖5-D）。表明鹽脅迫嚴(yán)重影響鹽敏感糜子資源陜78的NPQ，但對耐鹽性糜子資源伊選大紅糜影響不明顯。

圖4 鹽脅迫下葉綠體的透射電鏡觀察

3 討論

3.1 糜子萌發(fā)期耐鹽性評價

作物耐鹽性不僅是對鹽脅迫造成的滲透脅迫和離子毒害的適應(yīng)性，而且其耐鹽性是多個發(fā)育時期、多個耐鹽性狀的綜合反映。許多研究表明，不同作物對鹽脅迫的響應(yīng)差異很大，同種作物不同品種間耐鹽性也存在較大的差異[28-29]。作物不同生長發(fā)育階段對鹽脅迫的耐受性不同，各發(fā)育時期也不表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性[30-31]。糜子起源于中國北方，是世界上最早馴化的作物之一，廣泛種植于亞洲、歐洲和其他大洲的干旱、半干旱地區(qū)[32]。糜子生育期較短（為60—90 d），具有高耐鹽性。對營養(yǎng)資源利用效率高，水分需求極低，是邊緣地區(qū)的先鋒作物[33-34]。糜子具有耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特性，對非生物脅迫具有很強的耐受性[14]。目前，糜子耐鹽性研究僅從單個品種或者幾個品種芽、苗期進(jìn)行耐鹽性評價鑒定[22-23,35]。蘇興國等[36]認(rèn)為采用單一時期或單一指標(biāo)評價作物的耐鹽性，不能將實際生長情況下的耐鹽性客觀真實地評價。因此，需要將作物大量品種不同發(fā)育時期的生長發(fā)育指標(biāo)、形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化等指標(biāo)相結(jié)合，對各個發(fā)育時期耐鹽性綜合評價[37]。劉敏軒等[38]采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)對中性混合鹽脅迫下的16份黍稷種質(zhì)芽、苗期綜合評價，認(rèn)為Na+含量及游離脯氨酸含量等生理指標(biāo)可作為黍稷種質(zhì)耐鹽性評價的指標(biāo)。張國偉等[39]采用隸屬函數(shù)法對不同濃度NaCl水溶液脅迫下13份棉花品種萌發(fā)期及苗期進(jìn)行綜合評價，表明與發(fā)芽相關(guān)的指標(biāo)及活力指數(shù)和鮮重可作為萌發(fā)期耐鹽性鑒定的指標(biāo)，株高、地上地下干重、根系活力及凈光合速率可作為苗期耐鹽性鑒定的指標(biāo)。本研究采用相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析的方法，對鹽脅迫下100份糜子品種資源的耐受性進(jìn)行綜合評價和分類，認(rèn)為相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析等方法可準(zhǔn)確真實地反映糜子資源的耐鹽性，并將發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)作為糜子萌發(fā)期耐鹽性鑒定的指標(biāo)。

圖5 鹽脅迫下糜子葉片相對電導(dǎo)率、Fv/Fm、Y(Ⅱ)、NPQ的變化

3.2 糜子苗期耐鹽性評價

在鹽脅迫下，鹽分引起的滲透脅迫和離子毒害擾亂作物正常的生理代謝過程，抑制作物的生長發(fā)育，甚至使作物不能完成正常的生活史[40-41]。為適應(yīng)鹽脅迫的環(huán)境，作物的組織結(jié)構(gòu)會發(fā)生獨特的適應(yīng)性變化，比如氣孔關(guān)閉、蠟質(zhì)增多、減少水分的蒸騰散失，以適應(yīng)大量Na+造成的滲透脅迫和高濃度的離子毒害[42-43]。鹽腺及鹽囊泡增多，可以將體內(nèi)多于的鹽分排除體外，減小鹽分對作物的傷害[44]，但超過作物自身調(diào)節(jié)的程度，組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重的變化，甚至解體凋亡[45-46]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫時間的延長，高度耐鹽性糜子氣孔逐漸關(guān)閉，葉表面鹽囊泡增多變大，脅迫后期葉綠體外被膜逐漸降解。高度鹽敏感糜子鹽脅迫時間的延長，氣孔關(guān)閉，蠟質(zhì)增多，保衛(wèi)細(xì)胞失水空癟，副衛(wèi)細(xì)胞出現(xiàn)解體凋亡，葉綠體逐漸失去內(nèi)外膜、膨脹，由橢圓形變成近似圓形，基粒扭曲排列紊亂，類囊體膨大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)降解出現(xiàn)空泡化，這一結(jié)果表明葉片細(xì)胞形態(tài)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化與糜子耐鹽性緊密相關(guān)，將糜子對鹽脅迫的耐受性可視化，可作為糜子苗期耐鹽性快速鑒定的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)。

在鹽逆境脅迫下，過量的鹽分會使作物體內(nèi)累積大量活性氧，進(jìn)而氧化細(xì)胞膜系統(tǒng)，細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能遭到破壞，細(xì)胞膜的滲透性增大，電解質(zhì)滲漏，相對電導(dǎo)率增加[47-48]。付晴晴等[49]發(fā)現(xiàn)耐鹽性較強的A15、A17比耐鹽性較弱的1103P葡萄株系相對電導(dǎo)率升高幅度小。本研究結(jié)果表明，隨著鹽脅迫時間的延長，高度鹽敏感性糜子資源陜78相對電導(dǎo)率增加的幅度明顯高于高度耐鹽性糜子資源伊選大紅糜。說明在鹽脅迫下，陜78細(xì)胞膜受傷害程度較大。這一結(jié)果顯示相對電導(dǎo)率與細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能破壞程度緊密相關(guān)。

4 結(jié)論

篩選出伊選大紅糜等11個萌發(fā)期高度耐鹽品種資源，B75-5等71個耐鹽品種資源，東鄉(xiāng)朵麻糜等14個鹽敏感品種資源，陜78等4個高度鹽敏感品種資源。質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaCl溶液可作為糜子品種資源耐鹽性評價和鑒定的標(biāo)準(zhǔn)濃度。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)可作為糜子萌發(fā)期耐鹽性鑒定指標(biāo)，掃描電鏡下氣孔的狀態(tài)、葉表面的變化及透射電鏡下葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化可作為糜子耐鹽性鑒定的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)，相對電導(dǎo)率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為糜子耐鹽性鑒定的生理指標(biāo)。

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Salt-Tolerance Evaluation and Physiological Response of Salt Stress of Broomcorn Millet (L.)

YUAN YuHao1, YANG QingHua1, DANG Ke1, YANG Pu1, GAO JinFeng1, GAO XiaoLi1, WANG PengKe1, LU Ping2, LIU MinXuan2, FENG BaiLi1

(1College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

To evaluate the tolerance of broomcorn millet cultivars to salt stress, explore the physiological responses of different salt-tolerant broomcorn millet to salt stress, and establish the salt tolerance identification index system of broomcorn millet, the salt tolerance of broomcorn millet was studied.The growth parameters of 100 genotypes of broomcorn millet at germination stage and the physiological parameters of different salt-tolerant broomcorn millet at seedling stage were measured under salt stress. The tolerance of each variety to salt stress was evaluated by correlation analysis, principal component analysis, cluster analysis and physiological responses to salt stress.the results showed that the measured values of each shoot in the germination stage under 1% NaCl solution stress were lower than that of the control. Correlation analysis showed that there was a significant correlation in the different germination indexes, and there was a significant negative correlation with the relative salt damage rate. The principal component analysis resultsshowed root fresh weight, germination index and germination rate were the larger load in germination factors and these indexes were considered as the main indexes to identify salt tolerance of broomcorn millet germination. The 100 broomcorn millet cultivars were sorted four groups according to the cluster analysis. The cluster analysis results showed eleven cultivars such as Yixuandahongmi, Wujushu, Baishu etc. were classified into salt-tolerant cultivar group, four cultivars including Humengheinianmi, Xiaoheishu, Linheshuanglishu, and Shaan78 were classified into salt sensitive group. There were great differences between salt tolerant cultivars and salt sensitive cultivars in morphological structure and physiological indexes. The scanning electron microscope results showed salt bladders appeared on the surface of salt-tolerant cultivars, the stomatal aperture size was barely changed. The salt-sensitive cultivar showed the stomata were closed in salt-sensitive broomcorn millet cultivar, and the surface of the leaf become rough, and the guard cells death occurred. With the increase of treatment time, the salt tolerant cultivar chloroplast changed from ellipsoid to spherical and starch granules increase, membrane disrupted, grana lamella arranged loosely, the thylakoids swollen and even disintegrate. With the days of salt stress increasing, the relative conductivity were increased. However, the relative conductivity in salt-tolerant broomcorn millet cultivar were lower than salt-sensitive broomcorn millet cultivar. The decreasing of Fv/Fm、Y(Ⅱ) and NPQ in salt-tolerant broomcorn millet cultivar were less than salt-sensitive broomcorn millet cultivar.1% NaCl solution could be used as the suitable concentration of salt tolerance in broomcorn millet. The results showed that salt tolerance evaluation of broomcorn millet was affected with multiple indexes, and root fresh weight, germination index and germination rate could be used as the evaluation indexes of salt tolerance in germination stage. Stomatal state and chloroplast structures could be used as the cytology indexes of salt tolerance evaluation. The relative conductivity and chlorophyll fluorescence coefficient could be used as the physiology indexes of salt tolerance evaluation.

broomcorn millet; NaCl stress; salt tolerance screening; physiological response

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.22.011

2019-06-11；

2019-07-31

國家谷子高粱產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-13.5-06-A26）、國家“十二五”科技支撐計劃（2014BAD07B03）、國家自然科學(xué)基金（31371529）、陜西省2017年省級現(xiàn)代農(nóng)作物種業(yè)項目（20171010000004）、陜西省小雜糧產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（NYKJ-2018-YL19）

袁雨豪，E-mail：yuanyuhao126@163.com。通信作者馮佰利，E-mail：fengbaili@nwsuaf.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）