趙群，李靜，竇召語，代靜靜，譚海剛

(青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266109)

固定化細胞技術具有高細胞密度、容易分離、可重復使用和連續(xù)化生產(chǎn)的優(yōu)點[1-3]，其載體大概分為有機載體、無機載體和復合載體三類[4-6]。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，固定化細胞發(fā)酵避免了細胞與水溶液難以分離、存在二次污染等問題，在食品行業(yè)應用前景廣闊[7,8]。王巖[9]使用SA和CaCl2對醋酸菌進行固定化，應用于香芋醋的釀制研究。Dias等[10]以SA和CaCl2對醋酸桿菌和葡萄糖酸桿菌進行固定化，制作了含有高含量有機酸和揮發(fā)性化合物的嘉寶果醋。

由于傳統(tǒng)固定化技術容易導致細胞活性喪失或機械強度較差，因此越來越多的學者將目光投向了新型復合載體固定化技術[11]。本研究以SA、PVA為固定化材料對醋酸菌進行復合固定化，以機械強度、硬度、包埋率、產(chǎn)酸量為指標優(yōu)化固定化條件，旨在選擇適合醋酸菌的固定化載體和工藝，從而提高醋酸菌的產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

醋酸菌：青島農(nóng)業(yè)大學食品發(fā)酵與釀酒工程實驗室保藏；海藻酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司；聚乙烯醇(聚合度1750±50)：天津市巴斯夫化工有限公司；氯化鈣：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 主要儀器設備

TA.XT Plus物性測試儀 北京微訊超技儀器技術有限公司；ZQPZ-228全溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%酵母浸粉，pH 6.0，滅菌后加3%無水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%酵母浸粉，pH 6.0，滅菌后加5%無水乙醇。

1.4 試驗方法

1.4.1 醋酸菌的制備

醋酸菌在種子培養(yǎng)基30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h后于4 ℃、3000 r/min離心15 min收集菌體，用磷酸緩沖液(0.2 mol/L、pH 6.0)洗滌2次，制成20 mg/mL菌懸液。

1.4.2 醋酸菌SA-PVA復合固定化顆粒制備

將醋酸菌懸液與SA(4%)-PVA(10%)溶液(9∶1)以1∶1的比例混合，用1 mL注射器緩慢滴入含0.6% CaCl2的飽和硼酸溶液中，靜置固定1.5 h，無菌水洗滌2次，待用。

1.4.3 SA-PVA復合固定化條件的優(yōu)化

1.4.3.1 SA濃度對醋酸菌固定化顆粒的影響

在10% PVA中分別添加1%、2%、3%、4%、5%的SA，制成醋酸菌固定化顆粒，測定其硬度、機械強度、產(chǎn)酸量和包埋率，確定較佳的SA濃度。

1.4.3.2 PVA濃度對醋酸菌固定化顆粒的影響

在4% SA中分別添加4%、6%、8%、10%、12%的PVA，制成醋酸菌固定化顆粒，測定其硬度、機械強度、產(chǎn)酸量和包埋率，確定較佳的PVA濃度。

1.4.3.3 CaCl2濃度對醋酸菌固定化顆粒的影響

分別采用0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%的CaCl2制成醋酸菌固定化顆粒，測定其硬度、機械強度、產(chǎn)酸量和包埋率，確定較佳的CaCl2濃度。

1.4.4 正交試驗

通過單因素試驗確定有機載體SA、PVA和固定液中CaCl2的較佳濃度，根據(jù)表1 L9(33)因素水平表，進行正交試驗并分析，最后對最優(yōu)試驗進行驗證。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test %

1.5 分析方法

1.5.1 醋酸菌固定化顆粒硬度的測定

使用TA.XT Plus物性測試儀，根據(jù)伍悅等[12]的方法稍作修改，選取7顆大小均勻的顆粒置于測試臺上，選用 P36R探頭，測試速度為1 mm/s 。

1.5.2 醋酸菌固定化顆粒機械強度的測定

挑選70顆大小均勻的顆粒放入250 mL三角瓶中，加7顆玻璃珠、40 mL蒸餾水，置于搖床振蕩15 h。計算完好的醋酸菌固定化顆粒數(shù)目(n)。

機械強度=n÷70×100%。

1.5.3 醋酸菌固定化顆粒包埋率的測定

根據(jù)肖雨等[13]采用的平板計數(shù)法。

1.5.4 醋酸菌固定化顆粒產(chǎn)酸量的測定

根據(jù)朱傳柳等[14]的滴定法稍作修改測定產(chǎn)酸量。取發(fā)酵液2 mL于三角瓶中，加入蒸餾水3 mL，以酚酞為指示劑，用0.2 mol/L的NaOH溶液將其滴定至粉紅色，記錄NaOH溶液消耗的體積(VNaOH)，計算總酸含量(以乙酸計，g/dL)=VNaOH×0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA-PVA復合固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 SA濃度對醋酸菌固定化效果的影響

圖1 SA濃度對醋酸菌固定化顆粒的硬度及機械強度的影響Fig.1 Effect of SA concentration on the hardness andmechanical strength of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

圖2 SA濃度對醋酸菌固定化顆粒的包埋率及產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of SA concentration on the embedding rate and acid yield of the immobilized particles ofacetic acid bacteria

由圖1和圖2可知，隨著SA濃度的不斷提高，醋酸菌固定化顆粒的硬度不斷增大，機械強度、包埋率和產(chǎn)酸量則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。4% SA制備的固定化顆粒機械強度、包埋率和產(chǎn)酸量分別為100%、(86.60±4.56)%和(3.13±0.15) g/dL，分別比1% SA固定化顆粒高了4倍、0.13倍和0.29倍，其顆粒硬度為(2512.86±154.13) g，較5% SA顆粒硬度小，但達到使用要求。故確定SA的最佳濃度為4%。

2.1.2 PVA濃度對醋酸菌固定化效果的影響

圖3 PVA濃度對醋酸菌固定化顆粒的硬度及機械強度的影響Fig.3 Effect of PVA concentration on the hardness and mechanical strength of the immobilizedparticles of acetic acid bacteria

圖4 PVA濃度對醋酸菌固定化顆粒的包埋率及產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of PVA concentration on the embeddingrate and acid yield of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

由圖3和圖4可知，PVA濃度對醋酸菌固定化顆粒的硬度、機械強度、包埋率和產(chǎn)酸量的影響相對較小，總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當PVA濃度為10%時，固定化顆粒效果最好，其硬度為(2512.018±54.96) g，機械強度為100%，包埋率為(86.09±3.83)%，產(chǎn)酸量為(3.12±0.24) g/dL。因此，選取10%為PVA的最佳濃度。

2.1.3 CaCl2濃度對醋酸菌固定化效果的影響

圖5 CaCl2濃度對醋酸菌固定化顆粒的硬度及機械強度的影響Fig.5 Effect of CaCl2 concentration on the hardness and mechanical strength of the immobilized particles of acetic acid bacteria

圖6 CaCl2濃度對醋酸菌固定化顆粒的包埋率及產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of CaCl2 concentration on the embeddingrate and acid yield of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

由圖5和圖6可知，隨著CaCl2濃度從0.1%增加到0.6%時，固定化顆粒的機械強度受到的影響較小，但其硬度、包埋率和產(chǎn)酸量有顯著提高，CaCl2濃度大于0.6%后均有所下降。因此，0.6%為CaCl2最合適的濃度。此時，固定化顆粒硬度達到(2515.96±55.51) g，機械強度為100%，包埋率為(86.09±3.08)%，產(chǎn)酸量為(3.15±0.17) g/dL，分別是0.1% CaCl2濃度制備顆粒的5.99倍、1.05倍、1.52倍和2.00倍。

2.2 正交試驗

以產(chǎn)酸量為測定指標，對SA濃度、PVA濃度和CaCl2濃度進行正交試驗，正交試驗設計與結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

續(xù) 表

由表2可知，SA、PVA和CaCl2濃度3個因素的極差R值分別為0.021，0.1523，0.0653，RB>RC>RA，即3個因素中PVA濃度對醋酸菌固定化顆粒產(chǎn)酸量的影響最大，CaCl2濃度的影響次之，SA濃度的影響最小。其中醋酸菌固定化最佳條件為A2B2C2，即最佳固定條件為4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2。

2.3 SA-PVA復合固定化最優(yōu)試驗

以正交試驗的最優(yōu)條件4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2對醋酸菌進行固定化，見圖7和表3。

圖7 醋酸菌SA-PVA復合固定化顆粒Fig.7 Acetic acid bacteria SA-PVA composite immobilized particles

表3 SA-PVA復合固定化最優(yōu)試驗Table 3 The optimum test of composite immobilization of SA-PVA

測定其顆粒粒徑在2.2 mm左右，其硬度為(2511.87±33.43) g，機械強度為100%，包埋率為(86.09±0.81)%，產(chǎn)酸量達到(3.13±0.09) g/dL，較游離醋酸菌的產(chǎn)酸量(2.63±0.13) g/dL提高了16.01%。

3 結(jié)論

本試驗以SA和PVA對醋酸菌進行復合固定化，并以SA濃度、PVA濃度和CaCl2濃度對醋酸菌復合固定化條件進行單因素試驗及正交試驗分析，最終確定醋酸菌最佳固定化條件為4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2。在此條件下，固定化顆粒粒徑在2.2 mm左右，硬度為(2511.87±33.43) g，機械強度為100%，包埋率為(86.09±0.81)%，產(chǎn)酸量達到(3.13±0.09) g/dL，較游離醋酸菌提高了16.01%。