華青松，宗朕，余越，張雨艷，周濤，王周明，柳志杰

(湖北工業(yè)大學(xué)，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

食醋作為一種調(diào)味品，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味，在人們的飲食中占有重要地位。原料經(jīng)液化、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等一系列的發(fā)酵過(guò)程，最終產(chǎn)生香氣宜人、營(yíng)養(yǎng)豐富的食醋[1]，醋酸發(fā)酵是食醋釀造中關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[2，3]。醋酸菌(acetic acid bacteria, AAB)是一類(lèi)嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，因其氧化乙醇生成醋酸能力強(qiáng)、高耐醋酸等特性而成為醋酸發(fā)酵的主要工業(yè)菌種[4]。醋酸菌AS1.41是工業(yè)上廣泛應(yīng)用的醋酸菌，其最適發(fā)酵溫度為28～33 ℃[5]。當(dāng)處于炎熱的夏季時(shí)，固態(tài)釀造中醋醅溫度升高，超出了常規(guī)醋酸菌適宜的生長(zhǎng)溫度，嚴(yán)重影響發(fā)酵質(zhì)量，增大發(fā)酵成本[6]。因而篩選能夠耐高溫且高產(chǎn)酸的菌株對(duì)于高溫條件下固態(tài)食醋的釀造具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品來(lái)源：江蘇鎮(zhèn)丹玉香醋酸醅。

試劑：葡萄糖、酵母提取物、CaCO3、NaOH、無(wú)水乙醇、瓊脂、瓊脂糖、MgSO4、酚酞、Taq DNA聚合酶、16S rDNA通用引物、普通凝膠DNA回收試劑盒、1 kb DNA Marker。

儀器：電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、立體培養(yǎng)搖床、紫外分光光度計(jì)、PCR儀、電泳儀、氣相色譜-質(zhì)譜連用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%、CaCO32%、瓊脂2%，115 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，待溫度降至50 ℃，加入4%無(wú)水乙醇。

液體培養(yǎng)基：酵母提取物1%、葡萄糖1%、MgSO40.01%，115 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，待溫度降低至室溫，加入4%無(wú)水乙醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌落篩選及純化

取5 g醋醅，30 ℃，200 r/min液體培養(yǎng)活化20 h，取活化后的菌液用生理鹽水梯度稀釋至10-5后，均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d。用接種環(huán)挑取長(zhǎng)勢(shì)良好且產(chǎn)生較大透明水解圈的單菌落用于平板劃線(xiàn)法分離純化。

1.3.2 產(chǎn)酸定性試驗(yàn)[7]

挑取純化后的菌落，接種于液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，取5 mL菌液，離心取上清液，以2.5 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，加入5% FeCl3溶液5～6滴，形成紅褐色沉淀即為產(chǎn)醋酸細(xì)菌。

1.3.3 菌株的16S rDNA鑒定

PCR擴(kuò)增體系：15 μL ddH2O、20 μL 2×Taq酶、2 μL引物27F、2 μL引物1492R、1 μL菌液作為模板。

擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性8 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃終延伸5 min，循環(huán)30次。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并加入DNA Marker作對(duì)比，將大小為1500 bp左右的片段切下用作凝膠DNA回收，最終產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAStar拼接后，在NCBI中進(jìn)行同源序列對(duì)比，選定相似度高的序列用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[8]。

1.3.4 菌種生物量(OD600)的測(cè)定

將AABA、AABC、AS1.41 這3株產(chǎn)酸菌按初始OD的0.01接種量，在30，37，40 ℃下，200 r/min搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的OD600，繪制相應(yīng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.5 產(chǎn)酸量的測(cè)定[9]

每隔24 h取上述培養(yǎng)菌液5 mL，滴加2～3滴1%的酚酞試劑，用0.5%的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，再根據(jù)堿液的消耗量來(lái)確定產(chǎn)酸量，公式為：

式中：V為滴定NaOH消耗的體積；V0為空白對(duì)照組消耗NaOH的體積；CNaOH為NaOH的濃度；60為NaOH的相對(duì)分子質(zhì)量[10]。

1.4 耐高溫醋酸菌的脂肪酸組成分析

取菌液離心后的菌體0.5 g，加入5 mL醋酸，渦旋混勻后加入20 mL氯仿-甲醇(2∶1，V/V)溶液，緩慢水浴振蕩30 min,3000 r/m離心10 min，取最下層液體，渦旋蒸發(fā)至干燥，加入0.1 mg十五酸、3 mL硫酸-甲醇溶液復(fù)溶，90 ℃放置2 h，加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液和500 μL正己烷，渦旋混勻，10000 r/min離心10 min，取有機(jī)層，即為脂肪提取物，再將提取的醋酸菌粗脂肪通過(guò)GC-MS分析脂肪酸組成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用SPSS 20和Origin 2017統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐高溫醋酸菌的初步篩選

將活化后的菌液均勻涂布在含CaCO3的固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)醋酸菌菌落特征，挑選菌落形態(tài)為圓形，中部凸起，表面呈光滑油脂狀，邊緣整齊且透明圈較大的菌落，進(jìn)行劃線(xiàn)純化培養(yǎng)3次，隨后進(jìn)行產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，進(jìn)一步在液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)復(fù)檢，初步篩選出2株耐37 ℃的產(chǎn)酸菌株，分別命名為菌株AABA和菌株AABC。

2.2 產(chǎn)酸菌株的鑒定

16S rRNA是細(xì)菌核糖體RNA的亞基之一，其編碼基因?yàn)?6S rDNA，16S rDNA編碼序列由保守區(qū)和可變區(qū)交替組成，其中保守區(qū)序列體現(xiàn)了細(xì)菌種間親緣關(guān)系，而可變區(qū)則體現(xiàn)了細(xì)菌的種間差異，通過(guò)對(duì)16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序可以快速、精確地鑒定未知菌種，比傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法更為高效和精確[11]。

本試驗(yàn)通過(guò)菌液PCR，對(duì)相應(yīng)菌株的16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 AABA、AABC兩株菌16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR products of two strains of AABA and AABC

初步確定約1500 bp的擴(kuò)增片段為對(duì)應(yīng)菌株16S rDNA，隨后進(jìn)行凝膠DNA回收和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行拼接，確定菌株AABA的16S rDNA片段長(zhǎng)度為1359 bp，菌株AABC的片段長(zhǎng)度為1357 bp，再將序列在NCBI進(jìn)行同源序列Blast比對(duì)。

菌株AABA與NCBI同源序列Blast比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株AABA與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 1 Comparison results of strain AABA and NCBI database

續(xù) 表

由表1可知，選取與菌株AABA相似度最高的6株菌均屬于巴氏醋酸桿菌屬，菌株AABA與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知巴氏醋酸桿菌皆有較高的相似度。測(cè)序結(jié)果采用相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。

圖2 菌株AABA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain AABA

由圖2可知，菌株A和KT283054.1Acetobacterpasteurianusstrain FY-24等巴氏醋桿菌菌株親緣關(guān)系較近，相似度達(dá)到100%，因此確定菌株AABA屬于巴氏醋酸桿菌屬。菌株AABC與NCBI同源序列Blast比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 菌株AABC與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison results of strain AABC and NCBI database

由表2可知，菌株AABC與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中，與Acetobacterpasteurianusstrain DHMV3706等菌的相似度接近100%，再構(gòu)建菌株AABC的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

圖3 菌株AABC的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain AABC

由圖3可知，AABC與巴氏醋酸桿菌屬的親緣性較好，相似度可達(dá)100%，從而判定菌株AABC屬于巴氏醋酸桿菌屬。

2.3 溫度對(duì)產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)的影響

大部分醋酸菌的最適生長(zhǎng)溫度在30～35 ℃，溫度過(guò)低菌株生長(zhǎng)緩慢，溫度過(guò)高則抑制其生長(zhǎng)，老化加快，降低產(chǎn)酸速率，甚至導(dǎo)致菌體死亡[12]。為了探究高溫對(duì)所篩選菌株的影響，分別在30，37，40 ℃溫度下對(duì)其進(jìn)行液體培養(yǎng)，以工業(yè)菌株AS1.41作為參照，測(cè)定篩選菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn),結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度下菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4 Growth curves of strains at different temperatures

由圖4可知，在30 ℃培養(yǎng)條件下，菌株AABC生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)間晚于A(yíng)S1.41,但OD600值相差不大。而AABA相比于A(yíng)S1.41和AABC生長(zhǎng)較差，最終生物量?jī)H為兩個(gè)菌株的一半。在37 ℃下培養(yǎng)時(shí)，AS1.41和AABC生長(zhǎng)均受到一定抑制，而AABA則表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)狀況，兩株篩選菌與AS1.41在生物量方面沒(méi)有顯著差別。說(shuō)明菌株AABA最適生長(zhǎng)于溫度高于30 ℃的條件下。40 ℃下菌株AABA、AS1.41基本不生長(zhǎng)，而菌株AABC生長(zhǎng)狀況雖然同較低溫度相比，生物量呈下降趨勢(shì)，但最大OD600與30 ℃時(shí)接近。菌株AABA和AS1.41在培養(yǎng)第3天后就開(kāi)始衰亡，而菌株AABC從第6天開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，說(shuō)明在40 ℃時(shí)菌株AABC雖然生長(zhǎng)較慢，但仍可以達(dá)到較高的生物量。

2.4 溫度對(duì)產(chǎn)酸菌株產(chǎn)酸量的影響

醋酸菌產(chǎn)酸能力是評(píng)價(jià)醋酸菌特性的重要指標(biāo)之一。醋酸菌產(chǎn)酸速率及產(chǎn)酸量會(huì)受到溫度的影響，溫度太高會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)代謝，從而降低產(chǎn)酸量，因此評(píng)價(jià)耐高溫醋酸菌的產(chǎn)酸能力，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。本試驗(yàn)分別測(cè)定了30，37，40 ℃ 3個(gè)溫度下菌株AABA、AABC、AS1.41的產(chǎn)酸量，3株菌株在不同溫度下的最高產(chǎn)酸量見(jiàn)圖5。

圖5 30，37，40 ℃下AABA、AABC和AS1.41的產(chǎn)酸量Fig.5 Acid production of AABA,AABC and AS1.41 at 30，37，40 ℃

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，菌株AABC與AS1.41產(chǎn)酸量都在30 g/L左右，菌株AABA產(chǎn)酸量稍低；當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，菌株AABA和AABC的產(chǎn)酸量有顯著增長(zhǎng)，其中菌株AABA的產(chǎn)酸量可達(dá)到45.5 g/L，而AS1.41同30 ℃相比，產(chǎn)酸量顯著下降為16.0 g/L。培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，菌株AABC的產(chǎn)酸量為28.0 g/L，而菌株AABA和AS1.41基本不產(chǎn)酸。因此可以得出，AABA在37 ℃下具有比工業(yè)菌株AS1.41更高的產(chǎn)酸量，AABC在40 ℃高溫下生長(zhǎng)狀況較好，且有較高的產(chǎn)酸量，說(shuō)明AABC和AABA在高溫下具有比工業(yè)菌株AS1.41更好的表現(xiàn)，為耐高溫優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌株。

2.5 脂肪酸組成分析

微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞膜脂肪酸組成呈動(dòng)態(tài)變化，細(xì)胞中不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸組成隨細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境條件，如溫度、pH或各種生長(zhǎng)因子存在狀況及生長(zhǎng)期等變化發(fā)生改變[13-15]。微生物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成成分改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性來(lái)應(yīng)對(duì)不利的外在環(huán)境。本試驗(yàn)研究了30，37，40 ℃下菌株AABC以及30，37 ℃下AS1.41的脂肪酸組成，從脂肪酸組成的變化來(lái)初步探究醋酸菌耐高溫的機(jī)理。利用GC-MS測(cè)定脂肪酸組成，得到脂肪酸相對(duì)含量結(jié)果，見(jiàn)圖6。

圖6 溫度對(duì)醋酸菌細(xì)胞膜脂肪酸的組成成分影響Fig.6 Effect of temperature on the composition of fatty acids in acetic acid bacteria cell membrane

由圖6可知，溫度從30 ℃上升到40 ℃時(shí)，菌株AABC中C14∶0含量呈明顯的下降趨勢(shì)，從36.28%下降到9.3%，C16∶0呈顯著上升趨勢(shì)，從18.77%上升到47.8%。相比于A(yíng)S1.41，在37 ℃時(shí)，菌株AABC的C14∶0含量較高，C16∶0含量較低。隨溫度上升，兩株菌C18∶1和C18∶2含量上升，因而推測(cè)，為適應(yīng)不利環(huán)境，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸相對(duì)比例提高，增強(qiáng)了細(xì)胞流動(dòng)性，對(duì)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換以及代謝進(jìn)程產(chǎn)生影響，從而提高細(xì)胞對(duì)惡劣條件的抵抗能力。

3 結(jié)論

鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過(guò)程中，醋酸菌具有重要的作用，會(huì)對(duì)食醋的品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生重要影響。本試驗(yàn)從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選、純化、鑒定得到兩株具有一定高溫耐受性和產(chǎn)酸能力的巴氏醋酸桿菌屬菌株——AABA和AABC。通過(guò)對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃下菌株AABA生長(zhǎng)狀況好，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，產(chǎn)酸量為45.5 g/L。而菌株AABC在40 ℃高溫下，生長(zhǎng)狀況良好，產(chǎn)酸量達(dá)到28 g/L。通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸相對(duì)含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸相對(duì)含量提高，可能是由于不飽和脂肪酸相對(duì)含量的提高增強(qiáng)了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高了醋酸菌對(duì)高溫條件的適應(yīng)能力。本研究對(duì)耐高溫優(yōu)勢(shì)醋酸菌的篩選及對(duì)耐高溫機(jī)理的初步探討為高溫條件下高品質(zhì)固態(tài)發(fā)酵食醋的釀造提供了參考。