曹 敏，張 瑞，鐘 婷，虞道耿，陳銀華，駱 凱

（1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作

鄉(xiāng)土草的馴化選育和推廣利用不僅是解決我國牧草新品種緊缺的快捷和可行之途，還是一項(xiàng)符合國際發(fā)展趨勢的長期性工作[1]。摸清不同鄉(xiāng)土草種生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性，尤其是種子萌發(fā)和幼苗生長特性，是其馴化選育、高效栽培和推廣建植的重要前提。因?yàn)榉N子萌發(fā)和幼苗生長時期是植物生活史中最敏感和脆弱的階段，易受多種環(huán)境因子的綜合影響[2-3]；加之種子萌發(fā)特性在物種間具有很大的變異，共同決定了植物進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)的時間和幼苗期耐受生存環(huán)境的能力[4]。因此，研究多環(huán)境因素對種子萌發(fā)的影響，有助于掌握和預(yù)測物種的時空分布、建植率和收獲量等信息，也為鄉(xiāng)土草優(yōu)質(zhì)栽培和新品種推廣提供有用的參考數(shù)據(jù)[5-6]。

硬皮豆(Macrotyloma uniflorum)，豆科硬皮豆屬一年生鄉(xiāng)土草，具抗旱、耐貧瘠、抗病蟲害、生長勢強(qiáng)、粗放管理等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的綠肥和飼料作物[7]。有報道稱，該物種的干種子蛋白質(zhì)含量為23%～26%，脂肪含量0.9%左右，也是海南本地的一種低脂、高蛋白食用豆類食品[8]。崖州硬皮豆出苗快、長勢強(qiáng)、葉量多，與田間雜草競爭力強(qiáng)，可作為種木薯(Manihot esculenta)或其他果園優(yōu)良的行間控草作物，應(yīng)用前景廣闊。

關(guān)于崖州硬皮豆，目前僅見生物學(xué)特征和營養(yǎng)栽培研究的報道。崖州硬皮豆為海南特有的農(nóng)家品種，具有多項(xiàng)優(yōu)良性狀，其葉片具有敏感的感光性膨壓運(yùn)動特性，能夠調(diào)節(jié)葉面水分蒸騰強(qiáng)度，根系發(fā)達(dá)，根瘤豐富，發(fā)展崖州硬皮豆生產(chǎn)可對海南西南部秋冬旱季土地起到用養(yǎng)結(jié)合的良好效果；同時還可以作為常規(guī)和基因工程育種的寶貴材料[7,9]。崖州硬皮豆的馴化選育是鄉(xiāng)土草資源開發(fā)利用的一項(xiàng)科研成果，但相關(guān)的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性掌握甚少，這將成為全面發(fā)掘該品種生產(chǎn)和生態(tài)服務(wù)功能的阻礙。基于此，本研究以采自海南島的崖州硬皮豆為材料，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下分析不同溫度、光照、水勢、鹽分和埋深對種子萌發(fā)和出苗的影響，探討種子萌發(fā)特性對環(huán)境變化的適應(yīng)對策，為崖州硬皮豆種子學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為引種馴化和開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

崖州硬皮豆種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。種子于2019 年1 月采于海南省東方市感城鎮(zhèn)(18°50′ N,108°38′ E)，經(jīng)人工清選干燥后，置于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草研究中心種子庫(4 ℃)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子千粒重測定

隨機(jī)數(shù)取100 粒種子稱其重量，重復(fù)8 次，計算平均值。最終求得崖州硬皮豆的千粒重為(27.5 ±0.3) g。

1.2.2 種子硬實(shí)率測定

采用紙上萌發(fā)法測定所有供試種種子硬實(shí)率，隨機(jī)數(shù)取50 粒飽滿種子置于墊有雙層濾紙、直徑為11 cm 的干凈培養(yǎng)皿中，4 次重復(fù)，將培養(yǎng)皿置于25 ℃ (光照12 h，黑暗12 h)條件下培養(yǎng)，適時補(bǔ)充水分以保持萌發(fā)床濕潤，第28 天統(tǒng)計未吸脹種子數(shù)(種子吸水3 d 后，所有吸水種子數(shù)目均不再增加)。最終求得崖州硬皮豆的硬實(shí)率為(32.0 ±3.6)%。后續(xù)試驗(yàn)在開始前，種子均用解剖刀人工切破種皮，以破除硬實(shí)，之后將破除硬實(shí)的種子貯藏在室溫條件下，一周內(nèi)使用。

1.2.3 種子萌發(fā)的溫度和光照設(shè)置

同上使用紙上萌發(fā)法，分別置于恒溫15、20、25、30、35、40、45 ℃和變溫10 ℃/25 ℃、15 ℃/30 ℃、20 ℃/35 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。各溫度處理下分別設(shè)置光暗交替(12 h/12 h)和黑暗(24 h)兩個處理，其中黑暗處理采用雙層錫紙包裹培養(yǎng)皿模擬全黑暗條件的方法，每個處理設(shè)置4 個重復(fù)。以胚根突破種皮作為判斷種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，為得到更詳細(xì)的種子萌發(fā)動態(tài)，在種子吸水后萌發(fā)速率最快的時間段(前48 h)增加統(tǒng)計次數(shù)，之后每24 h統(tǒng)計一次萌發(fā)數(shù)，試驗(yàn)持續(xù)兩周。

1.2.4 水勢脅迫和NaCl 脅迫設(shè)置

同上使用紙上萌發(fā)法，在30 ℃、12 h/12 h 光暗交替的培養(yǎng)條件下，根據(jù)Michel 和Kaufmann[10]的方法及計算公式分別設(shè)置水勢為0 (CK)、 -0.2、-0.4、 -0.6、 -0.8、 -1.0、 -1.2 MPa 的PEG-6000溶液。相同培養(yǎng)條件下，分別設(shè)置0 (CK)、50、100、150、200、250、300、400 mmol·L-1的NaCl溶液。每個處理設(shè)置4 個重復(fù)，每重復(fù)50 粒種子，每24 h 統(tǒng)計一次，持續(xù)兩周，萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)同上。試驗(yàn)期間，每隔2 d 更換一次溶液以保持相對恒定的溶液濃度。

1.2.5 埋深設(shè)置

采用盆缽法，分別設(shè)置0、1、2、3、4、5、6、7 cm 共8 個埋深梯度，每個處理設(shè)4 個重復(fù)，每重復(fù)20 粒種子。試驗(yàn)基質(zhì)為農(nóng)田表層土壤，經(jīng)130 ℃高 溫 消 毒 處 理6 h。每24 h 統(tǒng) 計 一 次 出 苗率，以崖州硬皮豆子葉突出表層視為出苗，連續(xù)5 d沒有種子出苗視為試驗(yàn)結(jié)束，試驗(yàn)周期為21 d。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 萌發(fā)和出苗指標(biāo)

萌發(fā)(出苗)率 = (n/N) × 100%；

式中：n 為全部萌發(fā)(出苗)的種子數(shù)，N 為供試種子數(shù)。

萌發(fā)速率：采用Germinator 軟件包計算萌發(fā)達(dá)到非硬實(shí)種子數(shù)50%所需的時間(t50)，種子萌發(fā)速率用1/t50表示。

1.3.2 種子萌發(fā)的溫度模型

采用種子萌發(fā)速率與溫度(T，℃)模型，計算公式[11-12]為1/t50= k + mt。根據(jù)擬合出的方程式計算出最低臨界溫度(Tb)、最適萌發(fā)溫度(To)以及最高臨界溫度(Tc)。

1.3.3 統(tǒng)計分析與作圖

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)或雙因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s 法對平均值進(jìn)行多重比較。所有數(shù)據(jù)的錄入和作圖均使用Excel 2010 軟件。

2 結(jié)果

2.1 溫度和光照互作對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響

溫度、光照及二者互作對崖州硬皮豆種子萌發(fā)速率有一定影響，其中溫度對種子萌發(fā)速率(1/t50)影響極顯著(P＜0.01)，而光照對萌發(fā)速率(1/t50)的 影 響 不 顯 著(P ＞ 0.05) (表1)。恒 溫 條 件下，崖州硬皮豆種子萌發(fā)率隨溫度升高，整體呈先上升后下降的趨勢。萌發(fā)溫度在低于20 ℃和高于40 ℃時顯著下降(P＜0.05)，在10 ℃和45 ℃條件下種子均不萌發(fā)。萌發(fā)率在10 ℃/25 ℃、15 ℃/30 ℃和20 ℃/35 ℃之間差異不顯著(P ＞ 0.05)，3 個變溫均顯著低于20、25、30 和35 ℃恒溫(P＜0.05)，但顯著高于低溫10 、15 ℃和高溫45 ℃ (P＜0.05)。僅在15 ℃時，光照條件下的崖州硬皮豆種子萌發(fā)率顯著高于黑暗條件下的(P＜0.05)，而在其他溫度條件下，光照和黑暗對種子萌發(fā)率的影響均不顯著(P ＞ 0.05) (圖1)。

光暗交替(12 h/12 h)和黑暗(24 h)下，崖州硬皮豆種子萌發(fā)速率與恒溫溫度的線性關(guān)系表現(xiàn)出相似的結(jié)果。隨著溫度的升高，種子萌發(fā)速率(1/t50)呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的趨勢；種子萌發(fā)速率(1/t50)在0 ～ 30 ℃區(qū)間里與溫度呈直線正相關(guān)關(guān)系，在30 ～ 45 ℃時與溫度呈直線負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖2)。根據(jù)種子萌發(fā)速率(1/t50)和溫度之間的線性關(guān)系方程，推算出光照條件下Tb、To、Tc分別為11.0、32.8 和45.5 ℃，黑暗條件下Tb、To、Tc分別為13.4、32.4 和45.9 ℃。

表 1 溫度、光照及其互作對崖州硬皮豆種子萌發(fā)影響的雙因素方差分析Table 1 Two-way ANOVA for the effects of temperature, light, and their interaction on the germination of Macrotyloma uniflorum ‘Yazhou’

圖 1 光照和溫度對崖州硬皮豆種子萌發(fā)率的影響Figure 1 Effects of light and temperature on the germination percentage and index of M. uniflorum ‘Yazhou’

圖 2 種子萌發(fā)速率(1/t50)與萌發(fā)溫度的線性關(guān)系Figure 2 Linear regression of germination rate (1/t50)as a function of temperature

2.2 水分脅迫和NaCl 脅迫對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響

崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率隨滲透勢脅迫的加劇而降低(表2)。水勢在-0.4～0 MPa 的種子萌發(fā)率無顯著差異(P ＞ 0.05)，且均超過99%。水勢從 -0.6 MPa 開始，種子萌發(fā)率顯著降低(P ＜0.05)，達(dá)到 -1.2 MPa 時，萌發(fā)率僅為6.5%。

隨著NaCl 濃度的增加，崖州硬皮豆種子的萌發(fā)率呈逐漸下降的趨勢(表3)。當(dāng)NaCl 溶液濃度低于200 mmol·L-1時，崖州硬皮豆種子的萌發(fā)率相比較未處理(CK)條件下無顯著變化(P ＞ 0.05)；而NaCl 溶液濃度處于250～400 mmol·L-1時，崖州硬皮豆的萌發(fā)率被顯著抑制 (P＜0.05)。崖州硬皮豆種子萌發(fā)速率(1/t50)與NaCl 濃度呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表 2 水分脅迫對崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和1/t50 的影響Table 2 Effects of water stress on germination percentage and 1/t50 of M. uniflorum ‘Yazhou’

表 3 NaCl 脅迫對崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和1/t50 的影響Table 3 Effects of NaCl stress on germination percentage and 1/t50 of M. uniflorum ‘Yazhou’

崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率隨滲透勢脅迫的加劇而降低(表2)。水勢在-0.4～0 MPa 的種子萌發(fā)率無顯著差異(P ＞ 0.05)，且均超過99%。水勢從 -0.6 MPa 開始，種子萌發(fā)率顯著降低(P ＜0.05)，達(dá)到 -1.2 MPa 時，萌發(fā)率僅為6.5%。

2.3 埋藏深度對崖州硬皮豆種子出苗的影響

隨著埋藏深度的增加，崖州硬皮豆種子出苗率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖3)。埋藏深度在0～6 cm 時，崖州硬皮豆均有不同程度的出苗率，在1 和2 cm 埋深條件下出苗率較高，之后隨著埋藏深度的增加顯著下降(P＜0.05)，達(dá)到7 cm 時種子出苗率為0。埋藏深度在0 cm 時的出苗率顯著低于1 cm 的(P＜0.05)。

圖 3 埋藏深度對崖州硬皮豆種子出苗率的影響Figure 3 Effects of burial depth on seedling percentage of M. uniflorum ‘Yazhou’

3 討論

3.1 溫度和光照對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是一個極其活躍的生理生化過程，伴隨著一系列酶催化的物質(zhì)代謝反應(yīng)，而溫度影響酶的活性，在最適溫度范圍內(nèi)，酶的活性最強(qiáng)，因此適宜的溫度成為影響種子萌發(fā)的主要因素之一[13]。這一范圍內(nèi)，溫度過低或過高都不利于種子的萌發(fā)，通常使用溫度三基點(diǎn)(最低、最適、最高)來描述一個物種所能萌發(fā)的溫度范圍[14]。本研究根據(jù)種子萌發(fā)速率與萌發(fā)溫度的線性回歸方程推算，在11～46 ℃內(nèi)崖州硬皮豆可萌發(fā)，且在20～ 40 ℃下具有91%以上的萌發(fā)率，可見崖州硬皮豆種子具有廣闊的萌發(fā)溫幅，能在較大的溫度范圍內(nèi)建植。多數(shù)情況下，變溫環(huán)境相比較恒溫環(huán)境更有利于種子萌發(fā)。以羊草(Leymus chinensis)種子萌發(fā)特性最為典型，在28 ℃或35 ℃恒溫條件下，種子幾乎不發(fā)芽，當(dāng)處于5 ℃/28 ℃、5 ℃/35 ℃和16 ℃/28 ℃變溫時，種子萌發(fā)率可超過80%[15]。但是，變溫處理對崖州硬皮豆種子萌發(fā)不僅沒有影響，甚至還起到抑制作用，這可能是避免種子在溫度波動較大的地表萌發(fā)的一種適應(yīng)機(jī)制，與長芒草(Stipa bungeana)[16-17]的研究結(jié)果相似。在亞適溫條件下，相比較15 ℃恒溫，崖州硬皮豆的萌發(fā)率在10 ℃/25 ℃和15 ℃/30 ℃變溫時更高，說明變溫減緩了低溫對種子萌發(fā)的抑制作用。

不同植物種子萌發(fā)對光照的需求在種間存在較大差異，以形成對早期生境的生態(tài)適應(yīng)性，保證盡可能多的幼苗存活與建成[18]。一般認(rèn)為，種子萌發(fā)對光照的響應(yīng)主要由遺傳特性決定，但實(shí)際情況往往更為復(fù)雜，比如溫度可能在一定程度上改變種子萌發(fā)的光需求[19]。多數(shù)種子萌發(fā)的光控試驗(yàn)是在適宜的溫度、水分和O2條件下進(jìn)行的，但自然界各生境特征差異大且易出現(xiàn)極端環(huán)境，研究光照和溫度、水分、O2等環(huán)境因子的耦合作用對種子萌發(fā)影響，對光調(diào)控種子萌發(fā)機(jī)理的深入了解具有重要的意義。本研究表明，光照對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響因溫度不同而異。在適宜的萌發(fā)溫度范圍內(nèi)，崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)在光照和黑暗下差異不顯著(P ＞ 0.05)，說明崖州硬皮豆屬于光中性種子。Metcalfa 和Grubb[20]對來自東南亞低地雨林的140 種植物種子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)的需光性隨種子大小的增加逐漸減弱，崖州硬皮豆對光照需求小的特性可能與其種子較大(千粒重27.5 g)有關(guān)。在15 ℃的低溫時，光照卻顯著促進(jìn)崖州硬皮豆種子萌發(fā)(P ＜0.05)，說明低溫誘導(dǎo)崖州硬皮豆形成強(qiáng)迫性休眠，而光照可能作為打破強(qiáng)迫性休眠的信號因子[5,21-22]。

3.2 水分和鹽脅迫對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響

水分脅迫使外界環(huán)境形成大于種子內(nèi)部的滲透勢，這種差異將導(dǎo)致種子吸水速率減緩、萌發(fā)抑制或發(fā)芽延遲[23]。種子萌發(fā)對水分脅迫的反應(yīng)與植物抗旱性相關(guān)，能在一定程度上反映該物種在干旱環(huán)境下的生存能力。本研究發(fā)現(xiàn)，崖州硬皮豆在PEG 6000 脅迫水勢達(dá)到 -0.4 MPa 時，種子萌發(fā)率與對照相比未發(fā)生改變，這與Hu 等[16]在窄葉野豌豆(Vicia angustifolia)和‘蘭箭3 號’箭筈豌豆(V.sativa‘Lanjian 3’)上的研究結(jié)果相似。輕度干旱脅迫下，植物種子會通過改變可溶性糖和脯氨酸等調(diào)節(jié)物質(zhì)以維持相對正常的細(xì)胞膨壓，保證萌發(fā)生理過程順利進(jìn)行[24]。崖州硬皮豆萌發(fā)速率(1/t50)在 -0.2 MPa 時就已顯著下降(P＜0.05)，說明萌發(fā)速率對水分脅迫的變化與萌發(fā)率相比更為敏感，其原因可能是通過降低萌發(fā)速率，避免種子在水分缺乏的環(huán)境中大量萌發(fā)[3]。在劇變的環(huán)境中，這一機(jī)制可以提高種子較大且萌發(fā)吸水量較高的崖州硬皮豆幼苗的成活率。在鹽脅迫中同樣得到相似的結(jié)果。

鹽分是土壤的重要組成部分，過量鹽分會抑制植物生長和發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[25]。鹽分對種子萌發(fā)階段的影響程度決定該物種適應(yīng)廣泛分布的鹽漬化土地的能力，因而備受關(guān)注。景艷霞和袁慶華[26]發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿(Medicago sativa)種子在150 mmol·L-1NaCl 濃度條件下的萌發(fā)率顯著低于對照(P＜0.05)，當(dāng)濃度達(dá)到300 mmol·L-1時，種子萌發(fā)率為0。盧艷敏等[27]認(rèn)為，白三葉(Trifolium repens)對NaCl 的耐受濃度閾值小于300 mmol·L-1。汪永平等[28]對5 份草木樨(Melilotus)種質(zhì)進(jìn)行耐鹽性評價，結(jié)果表明，NaCl 濃度達(dá)到200 mmol·L-1時所有種質(zhì)的萌發(fā)率相比較對照均顯著(P＜0.05)降低。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽脅迫在200 mmol·L-1的NaCl 濃 度 以 下，對 崖 州 硬 皮 豆 萌發(fā)率沒有顯著的抑制作用(P ＞ 0.05)，與上述報道比較，崖州硬皮豆種子表現(xiàn)出較強(qiáng)的萌發(fā)耐鹽性，具有在鹽漬化地區(qū)推廣的潛質(zhì)。適應(yīng)生態(tài)理論認(rèn)為，植物種子萌發(fā)特性主要形成于原生境的適應(yīng)過程中[29]，崖州硬皮豆種子萌發(fā)對鹽分限制因子的響應(yīng)特征可能是長期適應(yīng)海濱鹽漬化區(qū)域進(jìn)化而成的[7]。

3.3 埋深對崖州硬皮豆出苗的影響

土壤埋藏使種子周圍的環(huán)境發(fā)生一系列變化，如光照、溫度、濕度、通透性以及土壤微生物等，對其萌發(fā)和出苗的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，淺層的土壤埋藏為崖州硬皮豆種子萌發(fā)創(chuàng)造了適宜的環(huán)境條件，使出苗率得到提高。超過適宜的埋藏深度后，崖州硬皮豆種子隨著埋藏深度的增加，出苗率逐漸受到抑制，其原因可能是頂土層的壓力大于種子突破土層的能力[30]。除此之外，隨著土壤深度的增加，土壤含氧量降低，種子在低氧分壓的環(huán)境下會進(jìn)入強(qiáng)迫休眠或吸漲后死亡[31]，這也可能是導(dǎo)致崖州硬皮豆出苗率下降的另一個原因。Hu 等[16]認(rèn)為，土壤埋藏對光強(qiáng)和光質(zhì)的改變可能是改變長芒草出苗率的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，崖州硬皮豆在適宜溫度條件下的種子萌發(fā)對光照不敏感(圖1)，與土壤表層(0 cm)種子出苗率較高的結(jié)果基本吻合。埋藏深度1 cm 的種子出苗率顯著高于土壤表層(P＜0.05)，其原因可能是表層水分蒸發(fā)過快，無法滿足崖州硬皮豆這類較大粒種子萌發(fā)的水分需求，這與前人在黃花磯松(Limonium aureum)[5]和霸王(Zygophyllum xanthoxylum)[32]等植物的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本研究得出以下主要結(jié)論：1)崖州硬皮豆種子具有約32%的硬實(shí)率，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)注意種子硬實(shí)的破除；2)崖州硬皮豆最適萌發(fā)溫度在32～33 ℃，光照對崖州硬皮豆種子萌發(fā)的影響取決于溫度的變化；3)隨著水分和鹽脅迫的加重，崖州硬皮豆種子萌發(fā)率和萌發(fā)速率呈降低的趨勢，當(dāng)PEG 滲透勢和NaCl 濃度分別達(dá)到- 1.2 MPa和400 mmol·L-1時，種子基本不會萌發(fā)；4)相比較最終萌發(fā)率，水分和鹽脅迫對崖州硬皮豆種子萌發(fā)速率的影響更為明顯；5)崖州硬皮豆種子適宜播種深度為1～2 cm。