劉永平 鄭學明 王茹冰 解冰 孔德華 吳曉蓉 傅行禮

(鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)中醫(yī)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212028；2江蘇大學醫(yī)學院；3南京市高淳人民醫(yī)院)

人體是一個非常復雜的生態(tài)系統(tǒng)，在我們的體表、腸道和口腔中活躍著非常豐富的微生物〔1,2〕。其中，人類腸道微生物最為豐富，總數(shù)在1 012～1 014之間，是人體細胞數(shù)量的10倍〔3〕。 成年人胃腸道微生物的其中絕大部分是細菌，主要類群為擬桿菌門和硬壁菌門，而放線菌門、變形菌門和疣微菌門數(shù)量次之〔4〕。越來越多的研究表明腸道微生物與人體的健康密切相關，腸道菌群的失調可以導致自身免疫性疾病、過敏反應、肥胖、炎癥性腸(IBD)、糖尿病等疾病〔5～7〕。由于絕大部分的腸道微生物無法通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)來鑒定，目前的研究手段主要是腸道宏基因組測序〔8〕。宏基因組學研究借助于大規(guī)模測序和生物信息學分析，能夠發(fā)現(xiàn)大量過去無法得到的未知微生物新基因或新的基因簇，這對于了解胃腸道微生物的群落組成、進化歷程和代謝特點，挖掘具有應用潛力的新基因具有重要意義。腎臟疾病的發(fā)生和腸道微生物有密切關系。Zheng等〔9〕發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌能促進三聚氰胺對腎臟的毒性，表明患者腎衰竭與其腸道菌群的組成和代謝活動密切相關。美國學者Vaziri等〔10〕研究了尿毒癥或飲食和藥物干預慢性腎臟病對腸道微生物的改變，研究人員通過研究糞便中提取的腸道微生物的宏基因組發(fā)現(xiàn)終末期腎臟病患者和健康人兩組之間有 190種細菌的分類有顯著差異：短狀桿菌科、肉桿菌科、腸桿菌科、鹽單胞菌科等細菌在終末期腎臟病(ESRD)患者中均顯著增加。Anders等〔11〕提出了腸道菌群對慢性腎病(CKD)和ESRD患者有潛在的免疫調節(jié)作用并討論了尿毒癥是如何引起患者腸道微生物組失調。腎病綜合征(NS)可由多種病因引起，最基本的特征是大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥及其他代謝紊亂為特征的一組臨床癥候群。目前對NS患者腸道微生物宏基因組還缺少研究。本研究主要目的是應用腸道微生物宏基因組學的方法來研究NS患者與健康人群腸道菌群在物種多樣性、菌落結構上的差異。

1 材料與方法

1.1樣品的準備和DNA的抽提 從鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)中醫(yī)院收集正常人和NS患者的糞便標本分別為8 份和30份。糞便標本儲存在含有DNA穩(wěn)定劑的糞便收集器中(Invitek,Germany),保存在-80℃冰箱備用。樣品中微生物宏基因組DNA的提取選擇德國Invitek公司的試劑盒PSP?Spin Stool DNA Plus Kit。提取的基因組DNA后需要經過質檢(1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測OD260/OD280)后可進行下一步的 PCR 擴增實驗。

1.2PCR擴增和產物的回收 設計細菌16S rDNA基因V3～V5區(qū)的通用引物，進行PCR擴增。正向引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，反向引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT (注：H:A/T/C,V:G/A/C,W:A/T)。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性及可靠性，我們選擇高保真的DNA聚合酶TransStart FastPfu DNA Polymerase(全式金生物)進行PCR反應并且①盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴增；②保證每個樣本擴增的循環(huán)數(shù)一致。首先隨機選取具有代表性的樣本進行預實驗確定能夠擴增出濃度合適的產物的最低循環(huán)數(shù)，再用這一循環(huán)數(shù)擴增所有樣品中的16S rDNA基因V3～V5區(qū)。每個樣本做3個重復，反應結束后將同一樣本的PCR產物混合，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3測序和質控 參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行定量，再按照每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合。用TruSeqTM DNA樣品準備試劑盒進行Miseq文庫構建，Illumina Miseq測序儀器上進行雙端(PE)高通量測序。根據(jù)PE測序讀長(reads)之間的重疊關系，將成對的reads拼接成一條序列，同時對reads的質量和合并的效果進行質控過濾，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)進行下一步的生物信息學分析。質控參數(shù)：①過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20 bp，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；②根據(jù)PE reads之間的重疊關系，將成對reads拼接成一條序列，最小重疊長度為10 bp；③拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；④根據(jù)序列首尾兩端的條形碼和引物區(qū)分樣品，并調整序列方向，條形碼允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。

1.4生物信息學分析 用Usearch軟件(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)對所有序列進行優(yōu)化序列進行OTU(Operational Taxonomic Units)劃分〔12〕。OTU分析步驟如下：①提取非重復序列；②去除沒有重復的單序列；③按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用Silva(版本128，http://www.arb-silva.de)對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類學水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成〔13〕。基于OTU的注釋數(shù)據(jù)，我們得到每個樣品中物種組成、群落結構等信息。進一步，在I-Sanger生信云(http://www.i-sanger.com/)上統(tǒng)計分析腎病綜合征患者和正常人腸道細菌多樣性，物種組成的差異。

2 結 果

2.1PCR結果 16S rDNA的擴增由于16S rDNA較長(1.5 kb)，我們只能對其中經常變化的區(qū)域也就是可變區(qū)進行測序。16S rDNA包含有9個可變區(qū)，分別是v1～v9(ref)。通過提取樣品的總基因組DNA，利用細菌16S rDNA V3～V5區(qū)(586 bp)的通用引物進行PCR擴增。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，所有的樣品能擴增出PCR條帶，位于750～500 bp。

1～30：NS患者樣本；31～38： 正常人樣本圖1 PCR電泳結果

2.2樣品測序結果及測序深度 Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)重疊關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析。統(tǒng)計顯示測序讀長主要集中在420～460 bp，每個樣品中的有效序列數(shù)量為30 000多至40 000多不等。為了檢測本次測序深度，我們通過隨機抽樣法分析了各樣品的稀釋曲線。結果如圖2所示，測序的38個樣品的稀釋曲線都已趨于平緩，表明本次測序的深度基本達到要求，再增加測序的數(shù)據(jù)量對OTU的發(fā)現(xiàn)貢獻不大。

圖2 測序樣品的稀釋曲線

2.3腸道菌群物種多樣性分析 在所有的樣品中，細菌種類最少的不到100種，最多的不超過300種，進一步統(tǒng)計分析患者和健康組物種多樣性，結果表明NS患者的細菌種類明顯低于健康人群，見圖3。

圖3 NS組和健康組腸道細菌種類數(shù)

2.4NS患者和健康人腸道菌群組成差異分析 基于OTU的物種注釋，進一步對NS患者和正常人腸道細菌菌群的群落結構進行統(tǒng)計分析，結果表明NS患者腸道芽孢桿菌綱及乳桿菌目較健康人明顯增多；而belta-變形菌綱、假單胞菌科、假單胞菌目、伯克氏菌目、鏈孢囊菌目、放線孢菌目顯著降低。見圖4。

A：NS組和健康組不同科的腸道細菌平均所占比例；B：NS組和健康組腸道細菌科級水平圖4 NS組和健康組腸道細菌科級水平差異性分析

3 討 論

正常人腸道菌群的種類有500到上千種,但我們只在每個糞便標本中檢測到不超過300種細菌，可能的原因是我們沒能檢測到很多低豐度的細菌。本實驗結果表明：NS組和健康組腸道菌群在門、綱、目、科、屬分類水平上都存在統(tǒng)計差異，其中目水平的差異最大；然而在物種水平上，NS組和健康組之間沒有統(tǒng)計學差異，主要的原因是組內不同的樣品在物種組成上差異很大。

研究表明人體胃腸道微生物的組成在出生后一年內就已建立，一年以后嬰兒的腸道菌群就與成人相似并保持穩(wěn)定，但飲食習慣、用藥等都會影響胃腸道微生物的組成〔14〕。其實，正常人腸道菌群差異很大，所以腸道宏基因組的研究需要更大的樣本，只有更大的樣品、更多的數(shù)據(jù)才能得到更精確的結論。綜上所述，研究結果揭示了NS組和健康組腸道菌群多樣性方面有明顯差異,菌群結構亦存在較大的差別。該研究結果為將來深入研究某一特定差異菌的對NS發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制打下基礎。