錢林華

(浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院婦產科，浙江 杭州 310006)

卵巢癌是目前全球發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤疾病之一，該病的死亡率更是居于全世界婦科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在發(fā)病初期缺乏特定的征象，因此該疾病在診斷時確診非常之困難。即使卵巢癌病灶發(fā)現(xiàn)較早，其患者的術后生存率仍不理想，主要是由于手術只能切除肉眼可見的病灶，對于隱匿的轉移灶則無作用。而且相當一部分的患者往往在確診時病情就已經(jīng)發(fā)展到了中晚期，從而失去了手術根除的機會。對于卵巢癌患者而言，放射線治療成為卵巢癌重要的輔助手段之一。臨床上卵巢癌的放療效果比較有限，其主要原因在于卵巢癌細胞對放射線的敏感性較低〔4,5〕。據(jù)此可知，研究提高卵巢癌細胞放射敏感性的手段以提高其放射治療的療效意義重大。表皮型脂肪酸結合蛋白(FABP)-5能夠通過脂肪酸代謝產物調控腫瘤細胞信號轉導，促進細胞的增殖活化；研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等癌細胞異常增殖時該蛋白表達顯著上調〔6～12〕。Ogawa等〔13〕報道，腫瘤細胞可以通過上調FABP-5基因表達，來鈍化其射線敏感性，抵抗射線的殺傷作用。目前就卵巢癌癌細胞中FABP-5基因和蛋白相對表達水平與卵巢癌細胞放射敏感性關系的研究還比較缺乏。本研究旨在通過雙向調控卵巢癌細胞中的FABP-5表達，探討FABP-5表達與卵巢癌細胞放射敏感性的關系，為卵巢癌細胞的放射治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及儀器、實驗動物 卵巢癌組織來自浙江大學醫(yī)學附屬婦產科醫(yī)院2015年4月至2016年6月婦產科收治住院并接受手術切除的新鮮標本，且患者術前均未行放療及化療。術后于浙江省實驗動物中心將每例所取癌及其周圍的正常組織(癌緣5 cm)于液氮保存?zhèn)溆谩２±龢吮揪?jīng)病理學證實為卵巢癌。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者皆知情同意。超凈工作臺(藝斯高貿易有限公司)，F(xiàn)ABP-5兔抗人多克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔多克隆抗體；GAPDH為小鼠抗人單克隆抗體，均來自艾康生物技術(杭州)有限公司。胎牛血清、磷酸緩沖液(PBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Hyclone公司；細胞培養(yǎng)箱(Heraeus Sepatech 公司生產)。Trizol試劑盒(Invitrogen生產)；十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測試試劑盒(北京益德益華生物有限公司)、TBS緩沖液(南京建成生物)。人卵巢癌SKOV3細胞購于中國醫(yī)學科學院。30只雄性成年BALB/C裸鼠〔7～8周齡，裸鼠體重為(18±2)g〕由浙江省實驗動物中心提供，室溫25℃，濕度50%～80%，SPF環(huán)境下自由飲水和采食，生產許可證號為SCXK(浙)2008-0118。

1.3卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的相對表達 采用實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western印跡分別測定各個配對組織標本FABP-5基因和蛋白表達，重復3次。用Oligo7.6 Demo軟件行引物設計，F(xiàn)ABP-5正向：5'-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3'，反向：5'-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3'，擴增長度212 bp；GAPDH正向：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴增長度121 bp。提取總RNA后逆轉錄為cDNA，通過2-ΔΔCt分析法，按內參基因GAPDH測定FABP-5 mRNA相對表達水平。取配對卵巢癌樣本，依據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒提取并對組織中FABP-5蛋白濃度進行測定，將組織裂解后并將之稀釋至同等的蛋白濃度后，5 min 100℃煮沸使蛋白變性，取蛋白40 μg/組，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)后；轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(200 mA，3 h)；室溫下5%的脫脂牛奶2 h(或4℃過夜)封閉；一抗1∶500，4℃過夜(或室溫下孵育2 h)；含5%脫脂奶粉的PBS(TPBS)3次洗滌，PBS洗滌1次；后行蛋白免疫印跡反應，拍照記錄后行軟件圖像分析，測定FABP-5蛋白質相對表達水平。

1.4卵巢癌SKOV3細胞體外培養(yǎng)建立實驗模型及分組 將凍存的SKOV3人卵巢癌細胞于37℃的恒溫水浴箱，30 s內行快速復蘇。融化后即刻將細胞轉至EP管內并向管中加入DMEM培養(yǎng)基，多次輕柔吹打，使細胞均勻分布，離心后棄去上清。復蘇后的SKOV3細胞通過DMEM完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106/ml備用。將人卵巢癌SKOV3細胞隨機平均分為3組:對照組(不實施任何基因轉染)、FABP-5上調組(將pcDNA3.1-FABP-5進行基因轉染)、FABP-5下調組(將FABP-5 siRNA進行基因轉染)。

1.5采用電穿孔法進行基因轉染 FABP-5 siRNA和pcDNA3.1-FABP-5分別由上海生工生物有限公司合成提供。取生長對數(shù)期人卵巢癌細胞行胰蛋白酶消化后收集細胞，通過羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HeBS)液(NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L，葡萄糖6 mmol/L ，Na2HPO40.75 mmol/L ， Hepes 25 mmol/L)行重懸、計數(shù)后，調整細胞密度至5×106/ml，取200 μl細胞液/次加入電擊杯，分別向對照組、上調組和下調組中分別加入4 μg生理鹽水、pcDNA3.1-FABP-5、FABP-5 siRNA；電轉后于室溫下2 min靜置，然后將3組SKOV3細胞分別置于3份6孔細胞培養(yǎng)板和96孔細胞培養(yǎng)板中(含2 ml細胞培養(yǎng)液)，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出3組細胞，棄去培養(yǎng)基后加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；定期細胞換液更換并篩選培養(yǎng)基，當細胞出現(xiàn)大量死亡，將G418的濃度減半后繼續(xù)培養(yǎng)篩選；培養(yǎng)10～14 d后，顯微鏡下觀察有穩(wěn)定的抗性克隆后停藥，對細胞進行擴大培養(yǎng)。

1.6RT-PCR和Western印跡檢測細胞中FABP-5 mRNA和蛋白的表達 轉染48 h后取3組細胞，方法同1.3。

1.7CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖 在SKOV3細胞基因轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過CCK-8法對卵巢癌細胞的增殖活化能力進行測定。轉染48 h后，分別收集3組細胞后接種于96孔板上，每個處理設3個復孔；繼續(xù)培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng)，細胞貼壁后再培養(yǎng)48 h，分別加 CCK-8試劑20 μl/孔后，振蕩搖勻；將處理后的細胞于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.0～1.5 h后，之后取出細胞通過酶標儀測定OD490值。

1.8克隆形成實驗觀察各組SKOV細胞的放射敏感性 轉染后48 h，3組細胞經(jīng)消化、細胞計數(shù)后，分別接種于6孔培養(yǎng)板中；繼續(xù)培養(yǎng)24～30 h，對3組細胞分別給予不同劑量Gy的單劑量照射(6 MV X射線，照射野為30×30 cm2，源皮距為100 cm)，放射后細胞靜置培養(yǎng)14 d，通過1%的結晶紫固定液20 min固定后，顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞克隆。通過Sigmaplot12.0軟件行細胞存活曲線擬合，并對放射敏感性參數(shù)D0、外推數(shù)N值和照射2 Gy時細胞的存活率(SF2)進行計算。

1.9TUNEL檢測細胞凋亡 轉染后48 h，將細胞取出培養(yǎng)箱后測定各組中SKOV3細胞凋亡情況。首先，輕輕吹打使細胞均勻分布，細胞洗滌后，滴加50 μl原位末端標記反應混合液，于濕盒中37℃下孵育1 h，滴加POD2轉化液50 μl，濕盒37℃孵育30 min，通過PBS(pH7.4)3次沖洗后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后，通過HE進行細胞復染后在顯微鏡下行圖像分析，細胞核棕黃色的細胞為凋亡細胞，計數(shù)總細胞數(shù)及凋亡細胞數(shù)，并計算細胞凋亡率。

1.10檢測調控FABP-5表達后X射線照射對卵巢癌細胞生長的影響 選取體重及日齡均相近的裸鼠30只，隨機平均分為3組，對照組10只、FABP-5下調組10只和FABP-5上調組10只。取轉染48 h后的各組細胞，通過胰酶消化重懸后，別接行相應組裸鼠右腋皮下0.5 cm處接種。裸鼠于通風、無菌、潔凈的SPF級動物房飼養(yǎng)，接種約1 w，在裸鼠右腋接種區(qū)可見米粒大小的移植瘤；各組裸鼠麻醉滿意后固定于解剖板上，放療(20 Gy X射線照射)40 d后處死裸鼠，分離右腋腫瘤組織后，計算瘤塊體積。

1.11統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差(One-way ANOVA)分析和t檢驗。

2 結 果

2.1卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的表達 卵巢癌組織和蛋白的相對表達水平明顯較癌旁組織高(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2FABP-5 mRNA和蛋白的表達 與對照組相比,FABP-5下調組細胞FABP-5 mRNA和蛋白相對表達水平顯著較低，F(xiàn)ABP-5上調組SKOV3細胞FABP-5 mRNA和蛋白表達顯著較高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 卵巢癌及癌旁組織FABP-5 mRNA與蛋白表達

表1 卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的表達

圖2 轉染48 h后各組FABP-5 mRNA和蛋白表達

表2 轉染后FABP-5 mRNA和蛋白表達

與對照組比較：1)P<0.05；表3、表4同

2.3細胞的增殖 與對照組相比，F(xiàn)ABP-5下調組癌細胞增殖水平顯著降低(P<0.05)，而FABP-5上調組中卵巢癌細胞的增殖水平明顯較FABP-5上調組升高(P<0.05)。見表3。

2.4卵巢癌細胞株SKOV3的放射敏感性 與對照組相比，F(xiàn)ABP-5下調組細胞平均致死劑量D0、SF2和N值明顯降低，F(xiàn)ABP-5上調組細胞D0、SF2和N值顯著升高(P<0.05)。見表4。

表3 轉染后各時間點各組細胞增殖率的變化

表4 卵巢癌細胞株SKOV3的放射敏感性

2.5細胞凋亡 與對照組〔(25.4±1.2)%〕比較，F(xiàn)ABP-5下調組卵巢癌SKOV3細胞凋亡率〔(58.6±0.9)%〕顯著增加(P<0.05)；FABP-5上調組〔(12.3±0.7)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 TUNEL法染色各組細胞凋亡(×200)

2.6各組聯(lián)合X射線照射對卵巢癌細胞的生長抑制 FABP-5上調組瘤體平均體積顯著大于FABP-5下調組(P<0.05)。20 Gy X射線照射后FABP-5下調組瘤體平均體積較照射前明顯減小(P<0.05)；而FABP-5上調組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表5 X射線照射對卵巢癌細胞的作用

與FABP-5下調組比較：1)P<0.05，與照射前比較：2)P<0.05

3 討 論

FABP家族是調控細胞內脂質代謝反應的一個蛋白家族，該家族與細胞代謝和機體炎癥通路也密切相關。FABP能夠高親和性地和疏水性基團結合，如與長鏈脂肪酸等脂類物質進行可逆性結合。FABP家族的不同成員在機體內不同組織中差異性表達，其主要參與脂肪酸代謝〔14〕。FABP-5(E-FABP)主要來源于表皮細胞，近來研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細胞增殖過程中FABP-5基因顯著上調，這提示FABP-5可能與多種腫瘤性疾病相關〔15～19〕。研究表明，其參與脂肪酸的胞內信號轉導、基因表達調控及運輸代謝等〔20〕；結合并轉運維甲酸，對過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)β/δ進行活化，是細胞內源性的抗氧化物質，能夠調節(jié)細胞的分化，促進增殖并抑制凋亡〔21〕。放療對癌癥細胞的干預機制主要是促進胞內產生高水平的活性氧(ROS)，后者可干擾DNA形成，降低腫瘤細胞活力〔22～25〕。而FABP-5是較好的內源性抗氧化性劑，可通過提高胞內抗氧化酶系統(tǒng)，捕捉或清除ROS，緩解ROS的毒殺作用，此系FABP-5影響卵巢癌細胞放射敏感性的重要原因〔26～29〕；通過抑制FABP-5表達，降低了其對ROS的捕捉能力，細胞內抗氧化狀態(tài)下降，細胞凋亡增加〔30～32〕；細胞生存能力下降。據(jù)此可知，上調FABP-5的表達可能更大程度地降低癌細胞的放射敏感性，而下調FABP-5的表達則可能提高其放射敏感性，進而利于放療的效果。

本試驗結果提示雙向調控FABP-5方法成功。人卵巢癌細胞的放射敏感性與FABP-5的表達高低關系密切，通過基因調控可以提高癌細胞的放射敏感性，增強放射治療的療效。