郝大林 孫成學 肖福斌 鄧放

(北華大學附屬醫(yī)院 1感染肝病科，吉林 吉林 132011；2肝膽胰外科)

我國每年新發(fā)肝癌病例約占世界肝癌的45%，肝癌的發(fā)病率居世界首位〔1〕。手術治療是目前肝癌的第一線治療方案，但70%確診為肝癌的患者由于肝癌的早期病變惡性程度高、發(fā)病隱匿、診斷率低而喪失了手術治療的機會〔2〕。因此，研究肝癌的非手術治療是當務之急。組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑(I)亞甲酰胺異羥肟酸(SAHA)和索拉非尼(SRFN)是臨床上常用的治療肝癌的藥物，主要用于治療一些無法通過手術治療的肝癌患者〔3,4〕。 雖然HDACI或SRFN可以單獨用于治療肝細胞癌(HCC)，但最近的研究表明，聯(lián)合應用SAHA和SRFN可以提高療效，減少毒副作用，達到綜合治療HCC的效果〔5〕。然而，合理組合用藥的基礎是深入了解使用藥物的機制。本實驗擬研究SAHA、SRFN和SAHA聯(lián)合SRFN對HepG2細胞生長、增殖、細胞周期及相關蛋白表達的影響，探討SAHA與SRFN協(xié)同作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)與分組 HepG2 細胞株(購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫)放置于 37℃、二氧化碳濃度為5%的孵育箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基的組成成分為含10%滅活小牛血清的 RPMI1640 及含 1%的青霉素與鏈霉素雙抗。細胞為上皮樣細胞，傳代頻率為2～3 d/次，取對數(shù)生長期的細胞為研究樣本。分為4組：對照組、SAHA(1.5 μmol/L SAHA處理)、SRFN(1.5 μmol/L SRFN處理)和SAHA聯(lián)合SRFN(1.5 μmol/L SAHA和1.5 μmol/L SAHA處理)。

1.2噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長 將HepG2細胞以5×104個細胞/孔接種到96孔板上，分別用0.1、0.5、1.0、1.5及2.5 μmol/L不同濃度的SAHA或SRFN處理HepG2細胞24、48、72 h，以0 μmol/L的SAHA或SRFN處理細胞24、48或72 h為對照組。MTT試劑盒經(jīng)標準化處理后，在570 nm處測量每個孔的光密度(OD)。每組設4個孔，重復3次。平均OD值作為最終OD值。SAHA或SRFN對HepG2細胞增殖的抑制率=(OD對照-OD處理)/OD對照×100%。

1.3流式細胞術檢測各組細胞周期及凋亡 將各組處理72 h后細胞用胰蛋白酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次(2 000 r/min離心5 min)，收集(1～5)×105細胞，加入500 μl的結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻，再加入5 μl碘化丙啶混勻，室溫下避光反應15 min。流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。采用FCSExpress3.0軟件進行分析處理，計算細胞凋亡率及細胞周期情況。

1.4Western印跡檢測不同處理組細胞中蛋白水平的表達 用SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN處理后，以細胞總蛋白提取試劑盒提取HepG2細胞的總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白(100 μg)轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，依次經(jīng)過封閉、一抗孵育、洗膜、辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育、洗膜，最后采用化學發(fā)光顯色試劑顯影并攝像，并進行分析。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對HepG2細胞增殖的影響 SAHA或SRFN以濃度/時間依賴性抑制HepG2細胞增殖，見圖1。同時SAHA聯(lián)合SRFN增強抗增殖作用，見表1。

2.2SAHA、SRFN和SAHA聯(lián)合SRFN對HepG2細胞周期和凋亡的影響 SAHA或SRFN誘導HepG2細胞的G0/G1期阻滯。與對照組相比，SAHA組和SRFN組細胞周期G0/G1期分別增加87.16或68.81%。SAHA聯(lián)合SRFN組細胞周期G0/G1期比SAHA組增加11.76%，比SRFN組增加23.91%，見表2。SAHA或SRFN組HepG2細胞凋亡率(19.21%±2.96%、12.86%±3.12%)明顯高于對照組(4.64%±0.35%，P<0.05)，但顯著低于SAHA聯(lián)合SRFN組(31.22%±3.65%，P<0.05)。

圖1 不同濃度處理后不同時間點SAHA和SRFN對HepG2細胞增殖的抑制作用

SAHA濃度(μmol/L)0.00.10.51.01.52.5SRFN濃度(μmol/L)0.0-10.09±2.0119.17±2.1521.84±1.8829.75±2.8939.23±2.530.13.07±0.4611.38±1.9420.97±1.5923.64±2.3630.28±1.1341.44±2.180.511.37±1.2416.68±3.3423.67±3.6426.79±3.4538.02±2.9449.96±3.871.016.47±1.9123.41±2.8929.41±1.1835.93±3.6945.01±3.0250.03±3.211.520.76±1.8626.85±3.0335.46±2.8543.48±3.2550.79±2.4653.51±3.842.525.41±2.6730.69±3.7436.72±3.0244.09±3.9449.83±4.0355.64±4.12

表2 SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對HepG2細胞周期的抑制率(%，n=6)

2.3SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN對HepG2細胞相關蛋白表達的影響 與對照組相比，SAHA或SRFN顯著上調(diào)P21表達(P<0.05)。SAHA聯(lián)合SRFN組p21蛋白表達顯著高于SAHA或SRFN組(P<0.05)。SAHA或SRFN顯著下調(diào)CyclinD1、Bcl-2表達(P<0.05)，而對Bax蛋白表達無明顯影響。SAHA聯(lián)合SRFN組CyclinD1、Bcl-2表達顯著低于SAHA或SRFN組(P<0.05)，見圖3和表3。

圖3 SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN組增殖、凋亡相關蛋白表達

表3 SAHA、SRFN或SAHA聯(lián)合SRFN組中增殖、凋亡相關蛋白表達的比較

與對照組比較：1)P<0.05;與SAHA+SRFN組比較：2)P<0.05

3 討 論

HDACI是基于表觀遺傳學理論發(fā)展起來的一種新型抗腫瘤藥物，具有療效好、無明顯毒副作用的特點〔6〕。HDACI通過抑制HDAC活性、調(diào)節(jié)組蛋白乙?；癄顟B(tài)、促進抗腫瘤轉錄因子的轉錄和表達、調(diào)節(jié)相關信號通路發(fā)揮抗腫瘤生物學效應〔7〕。SAHA是第二代酮類羥基酸HDACI，在微分子水平下具有很高的抗腫瘤生物學效應，通過調(diào)節(jié)基因，提高腫瘤細胞對其他化療的敏感性，從而達到治療癌癥的目的〔5〕。腫瘤細胞的增殖、分化受DNA的調(diào)控，盡管SAHA和SRFN的作用靶點不同，但兩者聯(lián)合使用可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。

Cha等〔8〕研究不同抗腫瘤藥物的作用靶點不同，但均通過誘導腫瘤細胞凋亡和改變腫瘤組織內(nèi)環(huán)境而顯示出抗腫瘤活性。細胞周期阻滯與細胞凋亡間有重要聯(lián)系。細胞分化相關基因p21通過誘導細胞G1/G0期阻滯而抑制細胞增殖和分化。如果藥物能夠上調(diào)腫瘤細胞中p21表達，就會使細胞G1/G0期比例增加，腫瘤細胞增殖就會受到抑制，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。CyclinD1是重要的推動細胞G1/S期相關基因，在許多腫瘤細胞中均有高表達，抑制其高表達可誘導細胞G1/S期阻滯〔9〕。Bcl-2可通過調(diào)節(jié)多種因素抑制細胞凋亡。因此，SAHA聯(lián)合SRFN通過誘導p21上調(diào)和cyclinD1下調(diào)，發(fā)揮細胞阻滯的作用，進而誘導HepG2細胞凋亡,而Bcl-2下調(diào)可促進HepG2細胞凋亡。

SAHA或SRFN通過上調(diào)p21蛋白的表達，下調(diào)Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達，抑制HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡。同時，SAHA和SRFN之間存在協(xié)同和疊加效應。