羅建安 楊樹(shù)法 于秀義 劉 欣 陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)學(xué)系，北京 100069)

克氏綜合征，即Klinefelter綜合征(Klinefelter’s syndrome, KS)，是最常見(jiàn)的性染色體三體綜合征。新生兒男嬰發(fā)病率為1/450至1/600[1]。KS患者的臨床表征為小睪丸、高促性腺激素性腺功能減退、乳房發(fā)育、學(xué)習(xí)困難?；颊咭谆继悄虿?、心血管、呼吸道和胃腸道疾病，常常導(dǎo)致較高的病死率[2-3]?；加蠯S的個(gè)體在嬰兒期、兒童期或成年期均患有醫(yī)療和社會(huì)功能障礙，對(duì)個(gè)人、家庭和社會(huì)產(chǎn)生有害影響。由于倫理的原因，對(duì)KS綜合征患者以及人體標(biāo)本組織進(jìn)行研究不易進(jìn)行。目前缺乏足夠有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停虼薑S綜合征的分子致病機(jī)制仍未被深入了解。過(guò)去的幾十年中，盡管通過(guò)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞模型(induced pluripotent stem cells, iPSCs)一定程度上揭示了KS綜合征異常發(fā)育機(jī)制[4]，但由于iPSCs細(xì)胞模型的局限性，使有關(guān)KS的研究相對(duì)滯后，迫切需要建立一種更貼近疾病真實(shí)狀況的KS綜合征細(xì)胞模型。圍產(chǎn)期來(lái)源的臍帶結(jié)締組織，即沃頓組織(Wharton’s jelly, WJ)，具有快速增生、免疫調(diào)節(jié)能力強(qiáng)、 維持多系分化能力、基因組穩(wěn)定、無(wú)致瘤性和遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。沃頓組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Klinefelter’s syndrome umbilical cord mesenchymal stem cells,KUMSCs)是多能細(xì)胞，可分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪和肌原細(xì)胞以及神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[5-6]。由于Wharton細(xì)胞譜系的可塑性，使其成為發(fā)育生物學(xué)研究和再生醫(yī)學(xué)研究的重要材料[7]。本研究中，筆者從具有47，XXY染色體核型的KS胎兒臍帶中獲取并建立了間充質(zhì)干細(xì)胞系，鑒定了細(xì)胞模型的質(zhì)量和體外成骨成脂分化的潛能。本研究所建立的Klinefelter綜合征胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞模型可成為研究圍產(chǎn)期KS胎兒異常發(fā)育的理想細(xì)胞模型，為深入研究KS疾病的致病機(jī)理和藥物研發(fā)提供了理想材料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞的來(lái)源與培養(yǎng)

本研究經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):2017-KY-043-01)，并獲得捐獻(xiàn)者的知情同意，從正常足月產(chǎn)及患有KS流產(chǎn)胎兒(采自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院)的臍帶中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2 主要儀器和試劑

PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；PAC-30型電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；漩渦混合器(北京科爾德科貿(mào)有限公司)等。CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoFisher公司)；低溫離心機(jī)(Allegra X-15R)美國(guó)Beckman公司；支原體檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D公司)；流式細(xì)胞儀(C6TM，美國(guó)BD公司)；胎牛血清(fetal bovine serum ,FBS)、胰酶(美國(guó)Gibco公司)；DPBS(美國(guó)Corning公司);秋水仙堿、Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司)；D-MEM/F12、間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(友康生物公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的原代分離、純化與擴(kuò)增培養(yǎng)

將收集到的臍帶組織置于無(wú)菌玻璃皿中，用DPBS反復(fù)沖洗3～4次，去除血漬和其他雜質(zhì)，然后剪碎至1.0 mm3左右大??；加0.075%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅱ型膠原酶15 mL(具體視組織塊大小)，37 ℃水浴鍋中振蕩消化40 min，將消化好的組織混懸液置于無(wú)菌大玻璃皿中，清洗1～2次后，將消化過(guò)的臍帶小組織塊置于新的100 mL的有蓋小玻璃瓶中，加入0.125%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰酶15 mL，37 ℃水浴鍋中振蕩消化40 min后將組織消化混懸液過(guò)濾(70 μm尼龍篩網(wǎng))，收集細(xì)胞懸液于50 mL離心管中，200 g低溫離心8 min。棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)。取10 μL細(xì)胞混懸液和1.0 μL 0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的臺(tái)盼藍(lán)混合后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活率測(cè)定，具體傳代瓶數(shù)視計(jì)數(shù)結(jié)果而定，傳代至3～4代后凍存KUMSCs及二倍體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(diploid umbilical cord mesenchymal stem cells，DUMSCs)細(xì)胞株(作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照)。

1.3.2 細(xì)胞安全性評(píng)價(jià)

預(yù)先獲取孕婦的病原體檢測(cè)信息，保證合格后進(jìn)行干細(xì)胞制備；在原代、分離和傳代擴(kuò)增培養(yǎng)后，獲取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)細(xì)菌、真菌、支原體、病毒、梅毒螺旋體等病原體和內(nèi)毒素，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，符合干細(xì)胞質(zhì)量要求。

1.3.3 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

使用P2～P3代的細(xì)胞，將細(xì)胞按(1.5～3.0)×103個(gè)/cm2的接種密度接種到6孔板中,按2.0 mL/孔的量加入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)，并標(biāo)注對(duì)照孔和待誘導(dǎo)孔。細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)，根據(jù)六孔板標(biāo)注加入對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)分化液和間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.3.4 成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化

使用P2～P3代的細(xì)胞，將細(xì)胞按(1.5～3.0)×103個(gè)/cm2的接種密度接種到6孔板中,按2.0 mL/孔的量加入臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基(D-MEM/F-12∶FBS=10∶1)，并標(biāo)注陰性對(duì)照孔和待誘導(dǎo)孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到100%以上時(shí)，根據(jù)六孔板標(biāo)注的加入對(duì)應(yīng)的誘導(dǎo)分化液和間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.3.5 G顯帶染色體核型分析

將處于分裂中期的細(xì)胞與100 ng/mL秋水仙堿一起培養(yǎng)50 min。將細(xì)胞用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶/0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))EDTA消化成單細(xì)胞，用低滲溶液KCl(0.075 mol/L)處理，用固定液固定2～3次。用預(yù)先配好的Giemsa工作液，充分染色10 min后用自然流水輕輕潤(rùn)洗，觀察染色體的形態(tài)和數(shù)量，并用染色體核型分析軟件進(jìn)行分析，保留圖譜。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞免疫表型

細(xì)胞用DPBS重懸到細(xì)胞濃度為5.0×106個(gè)/mL，并保證細(xì)胞總量在≥5×105/管。加入抗體前，將細(xì)胞懸液用DPBS洗滌2次，并棄去細(xì)胞上清，留取細(xì)胞沉淀。取EP管，將待檢細(xì)胞均分，并用DPBS洗滌2～3次，并在設(shè)置好對(duì)照管、檢測(cè)管和同型對(duì)照管后，加入對(duì)應(yīng)流式熒光抗體試劑，4 ℃環(huán)境下避光孵育30 min，每10 min輕輕彈散一次。孵育結(jié)束后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3.7 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳

為進(jìn)一步證明建立的細(xì)胞模型具有多向分化潛能，利用RT-PCR及凝膠電泳方法測(cè)定成脂分化標(biāo)志物過(guò)氧化物酶體增生劑激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)和成骨分化標(biāo)記物骨橋蛋白(osteopontin， OSP)基因的表達(dá)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26個(gè)循環(huán)，接72 ℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。使用18S作為內(nèi)部對(duì)照。用于PCR的引物序列:(PPARγ：F3′-5′:CCAAGCTGCTCCAGAAAATG, R3′-5′:AGGAGCGGGTGAAGACTCAT; OSP：F3′-5′:CACCTGTGCCATACCAGTTAAAC, R3′-5′:ATCCATGTGGTCATGGCTTT″; 18S：F3′-5′:GTAACCCGTTGAACCCCATT, R3′-5′:CCATCCAATCGGTAGTAGCG)。稱(chēng)取瓊脂糖2 g，加入到Tris-硼酸電泳緩沖液中，用微波爐加熱約5～10 min，自然冷卻至50 ℃左右，加入EB混勻，使EB終濃度為0.5 μg/mL，灌入插好梳子的凝膠槽中，約30 min后拔出梳子。將凝膠放入電泳槽中。吸取5 μL樣品加入凝膠孔中。在凝膠樣品中央或兩側(cè)加入5 μL的50 bp DNA Marker。電泳條件為120 V，35 min，將電泳后的瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 建立細(xì)胞系均符合安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)對(duì)分離培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒、人巨細(xì)胞病毒、EB病毒、人嗜T細(xì)胞病毒和梅毒螺旋體的抗體和抗原以及細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞建系標(biāo)準(zhǔn)(表1)。

表1 病毒、螺旋體、細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè)Tab.1 Detection of viruses, bacteria, fungi, mycoplasma, endotoxin

2.2 KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中分離、形態(tài)學(xué)特征及核型分析鑒定

細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后長(zhǎng)勢(shì)良好，臺(tái)盼藍(lán)染色后，細(xì)胞活率都在98%以上，鏡下觀察符合干細(xì)胞形態(tài)特征。為了檢測(cè)在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代過(guò)程中細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性，使用染色體核型分析技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)≥10代的DUMSCs及KUMSCs,結(jié)果顯示染色體核型分別為46,XY和47,XXY,說(shuō)明該模型的遺傳穩(wěn)定性良好(圖1)。

圖1 KUMSCs和DUMSCs細(xì)胞模型構(gòu)建示意圖及核型分析Fig.1 Diagram for KUMSCs and DUMSCs cell model building and cytogenetic karyotyping

2.3 KUMSCs和DUMSCs細(xì)胞免疫表型具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征

為確定所分離的胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特性，流式細(xì)胞分析技術(shù)顯示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物CD105、CD90、CD73、CD44、 CD29呈陽(yáng)性表達(dá)(均>98%)，抗原標(biāo)志物CD34、CD45、HLA-DR表達(dá)陰性(均<2%)；DUMSCs和KUMSCs對(duì)間充質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物CD105、 CD90、 CD73、 CD44、 CD29呈陽(yáng)性(且均>98%)；CD34、CD45、HLADR表達(dá)陰性(均<2%)，說(shuō)明DUMSCs和KUMSCs均符合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫學(xué)表征。詳見(jiàn)圖2。

圖2 DUMSCs和KUMSCs細(xì)胞免疫表型檢測(cè)Fig.2 Immunophenotyping analyses of KUMSCs和DUMSCs cell lines

2.4 KUMSCs和DUMSCs細(xì)胞具有成骨、成脂的分化潛能

表征MSCs的黃金標(biāo)準(zhǔn)是分化成多個(gè)譜系的能力。本結(jié)果顯示，PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定成脂分化基因PPARγ在誘導(dǎo)分化前后表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)； PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定成骨分化基因OSP在誘導(dǎo)分化前后表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)； 同時(shí)測(cè)定細(xì)胞的成骨分化潛能，在成骨分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21 d后，通過(guò)茜素紅染色指示骨礦化的該沉積物呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖3C)；另外測(cè)定細(xì)胞的成脂分化潛能，在成脂分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21 d后，通過(guò)組織化學(xué)染色技術(shù)觀察到細(xì)胞中油紅O脂滴的大量積累(圖3D) 。

圖3 KUMSCs和DUMSCs成骨、成脂分化潛能Fig.3 Osteogenic and adipogenic differentiation potential of KUMSCs and DUMSCs cell lines

3 討論

Klinefelter綜合征是人類(lèi)中常見(jiàn)的性染色體異常。幾乎所有的KS患者都表現(xiàn)出無(wú)精子癥，且易患糖尿病，心血管疾病和癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，后代的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加[8-9]，更好地了解KS發(fā)病基礎(chǔ)機(jī)制將有助于為患者提供新的治療方案。本研究從KS胎兒臍帶中成功分離并建立了間充質(zhì)干細(xì)胞KUMSCs細(xì)胞模型，這可用于KS的致病機(jī)制研究。以往研究[4, 10]KS綜合征常用的干細(xì)胞模型是胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和人成體細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞模型，例如源自成年人睪丸組織的iPSCs細(xì)胞模型。胚胎干細(xì)胞引起了倫理問(wèn)題，而iPSCs是通過(guò)體細(xì)胞的直接重編程產(chǎn)生的，增加了iPSCs細(xì)胞的致瘤性和臨床安全性的問(wèn)題[11-13]，尤其是c-myc 通過(guò)插入突變或破壞抑癌基因形成腫瘤[14]以及重編程引起的表觀遺傳記憶[15]。因此，在用于臨床應(yīng)用的ESC或iPSCs的過(guò)程中，需要采取關(guān)于安全性和功效的預(yù)防措施。

在早期MSCs臨床前和臨床試驗(yàn)中，移植的MSCs的安全性在動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)中得到了充分證明[16-17]。本課題組所建立的KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞模型經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)和核型分析技術(shù)鑒定其沒(méi)有發(fā)生染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，具有遺傳穩(wěn)定性，但仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究，以確保細(xì)胞模型的安全性。此外，對(duì)正常二倍體及KS胎兒來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)質(zhì)量控制檢測(cè)，包括病原微生物學(xué)(細(xì)菌、真菌、支原體、病毒、螺旋體)、內(nèi)毒素、細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活率等檢測(cè)，結(jié)果表明所建立的細(xì)胞系DUMSCs和KUMSCs具有安全性。

細(xì)胞的純度和狀態(tài)直接影響細(xì)胞的鑒別和誘導(dǎo)分化的效果。從Wharotn’s jielly中分離間充質(zhì)干細(xì)胞通常有兩種分離方式：外植體方法和酶消化方法[18]。外植體方法的缺點(diǎn)是片段通常漂浮在培養(yǎng)基中。與外植體方法相比，酶消化方法可以提供更均質(zhì)的細(xì)胞群和更一致的細(xì)胞數(shù)目。因此，本研究中先后使用酶消化法[0.075%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的Ⅱ型膠原酶和0.125%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰酶]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，成功獲得了理想的干細(xì)胞。本研究顯示KUMSCs具有干細(xì)胞的典型特征，但在細(xì)胞形態(tài)上與DUMSCs的形態(tài)卻有明顯區(qū)別，主要是旋渦狀生長(zhǎng)趨勢(shì)、細(xì)胞短梭形、細(xì)胞立體感、光澤度、分裂象方面存在一定差異。

流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果表明兩種細(xì)胞模型在CD105、CD73、CD90、CD44、CD29均大于98%，而CD34、CD45、HLA-DR均小于2%，均符合干細(xì)胞免疫表型的要求[19-20]。但免疫表型的檢測(cè)與細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)不同而表現(xiàn)出差異，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，筆者均選取大于P3代細(xì)胞純度更高的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析。

總之，本研究所建立的KS胎兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞系為高質(zhì)量多能干細(xì)胞，具有遺傳穩(wěn)定性和良好的分化潛能，可用于KS疾病的發(fā)病機(jī)制研究和藥物開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)。未來(lái)的研究，例如評(píng)估KUMSCs細(xì)胞模型的臨床藥物實(shí)驗(yàn)的研究，將進(jìn)一步表征這些細(xì)胞在潛在治療用途中的效用。