葉建斌 王璐 楊峰 張展 楊宗燦 劉向真 楊雪鵬 王根發(fā)

摘要：為闡明打葉復(fù)烤工藝對煙葉自然發(fā)酵的影響，考察室溫條件下原煙與片煙發(fā)酵過程中的化學(xué)成分變化規(guī)律差異。收集6個不同地區(qū)的初烤后原煙，同時對這6種煙葉進行模擬打葉復(fù)烤制成片煙，將原煙及片煙同時放置在室溫下自然發(fā)酵60 d，定期取樣并檢測常規(guī)化學(xué)成分（水溶性總糖、還原糖、淀粉、煙堿及總氮）含量。結(jié)果表明：隨著發(fā)酵進行，原煙中淀粉、水溶性總糖含量均有所減少，還原糖含量稍有增加，總氮含量呈下降趨勢;而片煙中淀粉、總糖及還原糖含量變化均不明顯，但總氮含量略有下降;統(tǒng)計分析顯示，原煙和片煙在發(fā)酵60 d后上述4種化學(xué)成分的變化量均存在差異性（0.01

關(guān)鍵詞：原煙;片煙;發(fā)酵;化學(xué)成分;變化規(guī)律;打葉復(fù)烤

中圖分類號： S572.9?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0212-06

煙葉發(fā)酵可有效改善煙葉品質(zhì)[1]。朱大恒等分析了烤煙發(fā)酵過程品質(zhì)及香吃味的形成特點，強調(diào)了發(fā)酵過程煙葉內(nèi)部化學(xué)成分轉(zhuǎn)變是煙葉吸食品質(zhì)形成的重要因素[2]。因此，研究煙葉發(fā)酵過程中的化學(xué)成分變化規(guī)律對于控制煙葉內(nèi)在品質(zhì)具有重要的意義。目前，一般將煙葉發(fā)酵分為人工發(fā)酵和自然發(fā)酵。

有部分研究探討了人工發(fā)酵過程中煙葉內(nèi)在化學(xué)成分含量的變化規(guī)律。閆克玉等研究了河南烤煙人工發(fā)酵過程的化學(xué)含量變化規(guī)律，結(jié)果表明，發(fā)酵過程中水溶性總糖、總氮、總植物堿、總揮發(fā)堿和石油醚提取物含量均有所減少，但總揮發(fā)酸含量則有所增加[3]。李曉等通過添加蛋白酶、淀粉酶并控制溫濕度，考察了人工發(fā)酵對煙葉蛋白質(zhì)降解及還原糖含量變化的影響，證明了添加酶發(fā)酵煙葉的可行性[4]。趙銘欽等通過添加煙葉發(fā)酵增質(zhì)劑，可促進煙葉內(nèi)部有機物質(zhì)的分解及轉(zhuǎn)化，有效改善了煙葉品質(zhì)[5]。

與人工發(fā)酵相比，自然發(fā)酵對于改善煙葉品質(zhì)具有更好的效果[2]。大量研究證實，烤煙在自然陳化（醇化）過程中，化學(xué)成分含量發(fā)生了不同程度的轉(zhuǎn)變。郭俊成等研究了皖南烤煙陳化過程的理化性質(zhì)含量變化規(guī)律，陳化過程煙葉總糖、煙堿、總氮含量都有不同程度的降低，陳化時間以不超過3年為宜[6]。周碧波等研究了不同產(chǎn)地片煙醇化過程中化學(xué)成分含量的變化情況，結(jié)果表明，總糖含量有所下降，揮發(fā)酸含量呈逐步上升的趨勢，部分產(chǎn)地煙堿含量有下降的趨勢，同時證實這些煙堿可轉(zhuǎn)化分解生成水溶性吡啶衍生物、氧化煙堿和煙酸[7]。劉東洋對烤煙陳化過程中的生化指標進行詳細研究，發(fā)現(xiàn)淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸、葉綠素含量均有所下降，石油醚提取物及類胡蘿卜素含量呈先降后升的趨勢[8]。

2種發(fā)酵的本質(zhì)是相同的，都是在適宜的溫濕度下利用煙葉表面或內(nèi)部微生物及生化酶促進內(nèi)含物的轉(zhuǎn)化，從而改善煙葉品質(zhì)，是一種煙葉的初加工方式[1]。因此，控制合適的溫濕度或存儲條件，可以在醇化過程中間接實現(xiàn)煙葉的人工發(fā)酵。如宋紀真等研究了不同貯存條件對片煙醇化的影響，結(jié)果顯示，在溫度較高、相對濕度適宜的環(huán)境下貯存的片煙外觀質(zhì)量較好，更有利于片煙吸味品質(zhì)的改善[9]。鄧賓玲等研究證明，片煙在溫度和相對濕度適宜的環(huán)境下存放相應(yīng)的時間后，香氣質(zhì)、香氣量明顯改善，雜氣、刺激性明顯減輕，余味、濃度適中[10]。不同發(fā)酵條件下，煙葉內(nèi)含物變化差異的主要原因是其表面或內(nèi)部的生物活性有所不同[11]。趙銘欽等研究了烤煙陳化期間的生物活性變化情況，證明微生物或酶的活性會隨著陳化過程而有所降低，并認為煙葉葉面活性是煙葉自然發(fā)酵的“催化劑”[12-13]。

然而，上述研究多集中在對打葉復(fù)烤后片煙自然陳化過程的研究，關(guān)于打葉復(fù)烤前原煙的自然發(fā)酵導(dǎo)致的化學(xué)成分含量變化規(guī)律未有相關(guān)的報道。劉東洋的研究證實，原煙表面微生物經(jīng)打葉復(fù)烤后數(shù)量和種類均有所減少[8]。筆者所在課題組在前期研究中也證實，一些降解大分子或產(chǎn)香相關(guān)的微生物在經(jīng)過打葉復(fù)烤后明顯減少，并影響后期的煙葉人工發(fā)酵過程[14]。本研究收集不同地區(qū)的初烤后原煙，在不控制溫濕度條件下，進一步考察原煙短期自然發(fā)酵過程的化學(xué)成分變化規(guī)律。結(jié)合實際生產(chǎn)過程，對原煙進行60 d發(fā)酵考察，并與復(fù)烤后的片煙進行平行對比，探索原煙內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)隨發(fā)酵時間點的變化而變化的情況。研究結(jié)果對于煙葉質(zhì)量控制及開發(fā)煙葉發(fā)酵工藝具有一定的理論指導(dǎo)意義。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與儀器

供試煙葉來自6個不同產(chǎn)地，分別為重慶C3F、洛陽C3F、云南C3F、南陽C3F、廣西C3F、貴州C3F，全部為初烤后的原煙，試驗前保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

主要儀器：AA3-連續(xù)流動分析儀，購自德國布朗盧比公司;Agilent 7820A氣相色譜儀，購自美國Agilent公司;KL512J數(shù)控恒溫水浴鍋，購自上海鴻經(jīng)生物儀器制造有限公司;BSA2202S千分位精確天平，購自賽多利斯（Sartorius）科學(xué)儀器（北京） 有限公司。其他儀器參考YC/T 159—2002《煙草及煙草制品?水溶性糖的測定?連續(xù)流動法》[15]、YC/T 216—2007《煙草及煙草制品?淀粉的測定?連續(xù)流動法》[16]、YC/T 161—2002《煙草及煙草制品?總氮的測定?連續(xù)流動法》[17]、YC/T 246—2008《煙草及煙草制品煙堿的測定氣相色譜法》[18]準備。

1.2?試驗方法

1.2.1?取樣方法

每種樣品原煙平均分成 2個部分：一部分直接進入倉庫儲存 （自然狀態(tài)下的原煙）;另一部分經(jīng)過 70 ℃ 高溫處理15 min后，采用模擬復(fù)烤方式去梗后打成片煙，然后進入倉庫儲存 （打葉復(fù)烤后片煙）。

以放置時間作為起始發(fā)酵時間。從發(fā)酵后0 d開始，7、14、21、28、35、45、52、60 d各取1次樣，每次取樣2 kg左右，將每次取得的樣品放入冷庫中存放，以保持取樣時的狀態(tài)，最后統(tǒng)一進行檢測。

1.2.2?檢測方法

煙樣中的水溶性總糖和還原糖含量參照YC/T 159—2002《煙草及煙草制品?水溶性糖的測定?連續(xù)流動法》[15]進行測定;煙樣中的淀粉含量參照YC/T 216—2007《煙草及煙草制品?淀粉的測定?連續(xù)流動法》[16]進行測定;煙樣中的總氮含量參照YC/T 161—2002《煙草及煙草制品?總氮的測定?連續(xù)流動法》[17]進行測定;煙樣中的煙堿含量參照YC/T 246—2008《煙草及煙草制品煙堿的測定氣相色譜法》[18]進行測定。每個項目均重復(fù)檢測3次，并計算平均值和標準差。

1.3?數(shù)據(jù)處理與分析

每個項目均重復(fù)檢測3次，并采用SPSS 19.0軟件計算平均值和標準差，對原煙及片煙的各化學(xué)成分含量的最終變化情況進行相應(yīng)的顯著性差異分析，計算P值，P≥0.05時認為無差異性，P<0.05時認為差異顯著，P<0.01認為差異極顯著。

2?結(jié)果與分析

2.1?發(fā)酵過程中煙葉淀粉含量的變化

由圖1可知，不同地區(qū)煙葉的淀粉含量有一定的差別，其中云南煙葉所含的淀粉含量最高，為4.39%（原煙）和4.21%（片煙），廣西所含的最低，為2.55%（原煙）和2.35%（片煙）。同一地區(qū)煙葉中，原煙中所含的淀粉含量高于片煙，這可能與打葉復(fù)烤過程淀粉降解有一定的關(guān)聯(lián)。楊波等的研究[19]也證明了這一點，淀粉含量的減少是由回潮和潤葉的高溫高濕環(huán)境使淀粉向糖類化合物的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的。

在60 d的發(fā)酵過程中，6個地區(qū)的原煙中淀粉含量均隨著發(fā)酵的進行發(fā)生明顯的下降，而復(fù)烤后的片煙則下降不明顯。如云南原煙中淀粉含量從4.39%（0 d）降到3.74%（60 d），而片煙中則從4.21%（0 d）降到4.03%（60 d），兩者的降解率存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異性（P=0.02<0.05），其他地區(qū)也呈現(xiàn)類似結(jié)果（圖1）。發(fā)酵過程中，原煙和片煙中淀粉降解率的差異，有可能是由于原煙表面的可以降解淀粉的微生物數(shù)量及種類多于片煙，或煙葉內(nèi)部淀粉降解酶的活性高于片煙。進一步分析6個不同地區(qū)的原煙，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵0～45 d之間淀粉含量快速下降，而45～60 d下降較慢，如廣西的原煙在前45 d淀粉含量由2.55%降到2.09%?而45 d后則降解到了2.01%。不同地區(qū)原煙中淀粉降解率有所不同，其中重慶為24.91%，南陽為23.59%，洛陽為28.94%，廣西為21.18%，云南為14.81%，貴州為17.51%。

2.2?發(fā)酵過程中煙葉總糖含量的變化

由圖2可知，同一地區(qū)煙葉中，片煙的總糖含量略高于原煙，但差異不顯著（對6個地區(qū)煙葉分析顯示均為P>0.05）。隨著發(fā)酵的進行，片煙中總糖含量基本維持不變，但原煙則下降較為明顯。不同地區(qū)原煙總糖含量均出現(xiàn)明顯減少，如重慶減少21.93%，南陽減少38.50%，洛陽減少29.21%，廣西減少31.59%，云南減少20.01%，貴州減少22.62%。前期的研究顯示，原煙表面微生物比復(fù)烤后片煙豐富，且數(shù)量要多[14]，因此，總糖含量的減少可能與微生物的代謝活性有一定的關(guān)系。在發(fā)酵過程中，原煙總糖含量的下降主要發(fā)生在前45 d，如重慶原煙從起始的17.65%降到13.82%，而在 45 d 后基本維持穩(wěn)定，其他地區(qū)原煙表現(xiàn)出相同的發(fā)酵結(jié)果。

2.3?發(fā)酵過程中煙葉還原糖含量的變化

由圖3可知，發(fā)酵起始階段，原煙中的還原糖含量要低于片煙。有文獻報道，打葉復(fù)烤可以使部分大分子多糖降解為小分子還原糖，從而引起還原糖含量的增加，如淀粉降解導(dǎo)致的還原糖含量增加[20]。在60 d的發(fā)酵過程中，原煙中的還原糖含量均表現(xiàn)出少量增加，如重慶原煙還原糖含量增加13.61%，南陽增加13.76%，洛陽增加13.35%，廣西增加12.36%，云南增加14.52%，貴州增加12.88%。在煙葉發(fā)酵過程中，還原糖的變化有兩面性，部分還原糖可能還會被微生物消耗掉，因此其增加量有限。原煙在發(fā)酵60 d的過程中，還原糖的有限增加證明了其降解大分子生成的還原糖量要稍高于其消耗的量。相反，片煙中還原糖含量則較為穩(wěn)定，發(fā)酵60 d的過程中基本維持不變。已有文獻報道顯示，片煙醇化半年后，還原糖含量有一定的減少[21]。郝廷亮等的研究表明，隨著片煙自然陳化時間延長，總糖、還原糖、煙堿和總氮含量都是逐步降低的[22]。在本研究中，片煙中還原糖含量維持穩(wěn)定與發(fā)酵時間短有一定的關(guān)系。

2.4?發(fā)酵過程中煙葉煙堿含量的變化

煙堿含量是決定煙葉品質(zhì)的重要化學(xué)成分之一，本研究對發(fā)酵過程的煙堿變化情況進行了分析。圖4顯示，在初始階段，6個不同地區(qū)的原煙煙堿量均高于片煙，差異量在 1%～6%之間。由于打葉復(fù)烤過程工藝需要高溫高濕條件[19]，因此可能會造成部分游離煙堿的散失，這也是導(dǎo)致煙葉煙堿含量經(jīng)打葉復(fù)烤后顯著下降的主要因素之一，這與袁逢春等的研究結(jié)果“打葉復(fù)烤后煙葉總糖含量、糖氮比及糖堿比升高，總氮、煙堿和鉀含量降低”相似[20]。隨著發(fā)酵的進行，原煙和片煙中煙堿均緩慢下降，且下降趨勢一致（圖4）。片煙和原煙的煙堿降解率差異較?。ńy(tǒng)計分析顯示，6種不同地區(qū)煙葉間原煙與片煙降解率差異P值均>0.05，即P重慶=0.43，P南陽=0.27，P洛陽=0.37，P廣西=0.28，P云南=0.19，P貴州=0.48）。發(fā)酵過程中煙堿含量的減少可能與部分煙堿降解菌有關(guān)，也與部分游離煙堿揮發(fā)相關(guān)。

2.5?發(fā)酵過程中煙葉總氮含量的變化

由圖5可知，不同地區(qū)煙葉發(fā)酵過程中，原煙總氮含量降低趨勢明顯，而片煙中總氮含量稍有下降，其下降主要表現(xiàn)在前30 d左右。經(jīng)60 d的發(fā)酵后，不同地區(qū)的原煙總氮降解率存在一定的差異，重慶為26.01%，南陽為20.83%，洛陽為26.58%，廣西為20.97%，云南為20.31%，貴州為17.30%。不同地區(qū)片煙總氮降解率則差異較?。褐貞c為6.75%，南陽為6.90%，洛陽為10.27%，廣西為5.68%，云南為7.57%，貴州為7.01%。煙葉中氮類化合物主要包括蛋白質(zhì)、煙堿及氨基酸。游離煙堿的揮發(fā)可能是導(dǎo)致總氮減少的主要原因之一。原煙比片煙總氮減少更多的原因可能是部分蛋白質(zhì)降解，或氨基酸類化合物被微生物內(nèi)源消耗后成為游離的揮發(fā)性氮化合物。在發(fā)酵過程中，原煙總氮含量的變化同樣表現(xiàn)出 “前45 d 較快，后15 d速度減緩”的趨勢。

3?結(jié)論與討論

在前期的研究中，原煙表面微生物經(jīng)打葉復(fù)烤后發(fā)生明顯變化，且會影響煙葉人工發(fā)酵過程[14]。經(jīng)過1個月的恒溫恒濕發(fā)酵后，原煙中的淀粉、蛋白質(zhì)、總氮等含量明顯減少，還原糖含量增加?煙堿含量也有一定的減少。由于在實際生產(chǎn)中，原煙存放一般在自然狀態(tài)下放置，并直接由復(fù)烤廠進行打葉復(fù)烤，此過程中煙葉化學(xué)成分含量變化規(guī)律尚未有相關(guān)研究。因此，本研究對6個地區(qū)的原煙與其模擬打葉復(fù)烤后的片煙進行自然發(fā)酵對比，以進一步分析打葉復(fù)烤工藝對煙葉化學(xué)質(zhì)量的影響，同時進一步驗證原煙表面微生物可以通過發(fā)酵對煙葉內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果顯示，自然發(fā)酵過程中原煙的化學(xué)成分含量的變化比片煙要劇烈，如淀粉、水溶性總糖含量均有明顯減少，但片煙中則無明顯變化。另外，6個地區(qū)的原煙中蛋白質(zhì)、總氮含量均呈下降趨勢，而片煙中總氮含量雖略有下降，但趨勢不明顯。值得注意的是，在發(fā)酵過程中，2種煙葉的煙堿含量均有不同程度地降低，但變化差異較小，這證明煙葉在自然發(fā)酵過程中，煙堿主要與環(huán)境有關(guān)，游離煙堿的揮發(fā)是導(dǎo)致其降解的主要原因。原煙在60 d的自然發(fā)酵過程中，前 45 d 化學(xué)成分含量變化較為劇烈，后15 d各化學(xué)成分含量漸趨于穩(wěn)定，這可能與原煙表面微生物在自然發(fā)酵過程中逐漸趨于穩(wěn)定或進入休眠狀態(tài)有一定的關(guān)聯(lián)，與之前的研究[12]有類似的結(jié)論。本研究結(jié)果證實復(fù)烤工藝是影響煙葉自然發(fā)酵的一個關(guān)鍵因素。

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