王德前，陸建強(qiáng)，董捷，黃敏婕

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 浙江 杭州 310021； 2.建德市建珂養(yǎng)殖有限公司，浙江 杭州 311612)

浙江省蛋雞養(yǎng)殖規(guī)?；?、集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖場(chǎng)多采用高密度飼養(yǎng)模式與高強(qiáng)度生產(chǎn)方式，加上夏季高溫高濕等極端天氣頻發(fā)，蛋雞熱應(yīng)激防控已成為困擾蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)的重要難題。蛋雞適宜飼養(yǎng)溫度為15 ℃～25 ℃，超過(guò)該范圍容易引發(fā)蛋雞應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體糖、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，輕則引起采食量、產(chǎn)蛋率和雞蛋品質(zhì)下降，重則直接導(dǎo)致蛋雞死亡，嚴(yán)重影響我省夏季蛋雞安全生產(chǎn)。

發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，機(jī)體細(xì)胞大量表達(dá)熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。HSPs作為一類多肽類蛋白，廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。HSP70是熱休克蛋白家族中最具代表性、分布最廣的蛋白成員，具有分子伴侶、協(xié)同免疫、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能[1]。HSP70表達(dá)水平與溫度變化緊密相關(guān)，對(duì)生物的熱耐受性有著重要影響。正常情況下機(jī)體中HSP70低水平表達(dá)，熱應(yīng)激條件下HSP70大量表達(dá)，行使分子伴侶功能，通過(guò)協(xié)助維持蛋白結(jié)構(gòu)、修復(fù)變性蛋白、阻止細(xì)胞內(nèi)變性蛋白蓄積等方式保護(hù)細(xì)胞免受損傷[2]。此外，HSP70還通過(guò)介入細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，直接參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[3]。熱應(yīng)激可促進(jìn)HSP70進(jìn)入H9C2心肌細(xì)胞核。HSP70表達(dá)抑制后，HSP70蛋白入核顯著降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。采用RNA干涉調(diào)低人胃癌細(xì)胞HSP70表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[5]。HSP70過(guò)表達(dá)抑制具有促進(jìn)細(xì)胞死亡功能的基質(zhì)金屬蛋白酶活性，保護(hù)細(xì)胞免受熱應(yīng)激損傷[6]。

本研究采用qRT-PCR方法監(jiān)測(cè)不同溫度條件下蛋雞心臟和肝臟組織中HSP70表達(dá)，以及肝臟組織中細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)、腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)因子配體(TRAIL)、應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)和蛋白激酶(PKB)等細(xì)胞凋亡信號(hào)通道關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平差異，探討HSP70對(duì)蛋雞熱耐受性與細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步明確蛋雞熱應(yīng)激發(fā)生機(jī)理，便于精準(zhǔn)采取有效措施進(jìn)行蛋雞熱應(yīng)激防控。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)計(jì)

90只170日齡伊莎蛋雞進(jìn)行2周適應(yīng)性飼養(yǎng)，平均分為對(duì)照組(25 ℃常溫飼養(yǎng))、實(shí)驗(yàn)組Ⅰ(30 ℃熱應(yīng)激處理)和實(shí)驗(yàn)組Ⅱ(35 ℃熱應(yīng)激處理)，每組30只(每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只)，試驗(yàn)期1周。無(wú)菌采集心臟、肝臟組織樣本，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品檢測(cè)

1.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取2～3 g組織樣本于液氮中研磨至粉末狀，稱取200 mg粉末，使用Trizol試劑盒提取總RNA，1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量，稀釋至100 ng·μL-1，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

參照禽類HSP70、CCO、TRAIL、SAPK和PKB基因序列，Primer 6.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，內(nèi)參基因采用雞β-actin，引物由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.2.3 反應(yīng)體系與程序

qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYRB Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性35 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸35 s，35個(gè)循環(huán)。溶解曲線：60 ℃升溫至95 ℃ 15 s，60 ℃保溫1 min，95 ℃保溫20 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用2-ΔΔCt法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行不同處理組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞心臟和肝臟組織HSP70表達(dá)情況

蛋雞心臟和肝臟組織HSP70表達(dá)量均隨溫度升高而逐步增加。實(shí)驗(yàn)組Ⅱ蛋雞心臟組織HSP70表達(dá)量最高(P<0.01)，25 ℃常溫對(duì)照組和30 ℃熱應(yīng)激處理間HSP70表達(dá)差異不顯著。各處理組蛋雞肝臟組織HSP70相對(duì)表達(dá)量差異顯著，30 ℃熱應(yīng)激處理組顯著高于25 ℃常溫對(duì)照組，35 ℃熱應(yīng)激處理組極顯著高于25 ℃常溫對(duì)照組和30 ℃熱應(yīng)激處理組(圖1)。

*—差異顯著(P<0.05)；**—差異極顯著(P<0.01)。圖2同。圖1 熱應(yīng)激對(duì)蛋雞心臟和肝臟HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響

2.2 蛋雞肝臟組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況

與正常對(duì)照組相比，蛋雞30 ℃熱應(yīng)激處理后的肝臟組織細(xì)胞色素C氧化酶(CCO)、腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)因子配體(TRAIL)和應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)基因相對(duì)表達(dá)量變化不顯著，35 ℃熱應(yīng)激處理使肝臟組織CCO、TRAIL、SAPK表達(dá)量極顯著降低；蛋白激酶(PKB)表達(dá)量極顯著升高。35 ℃熱應(yīng)激處理后，蛋雞肝臟PKB表達(dá)極顯著高于30 ℃熱應(yīng)激處理組和25 ℃正常對(duì)照組(圖2)。

圖2 蛋雞肝臟細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

HSP70廣泛參與各種維持和保護(hù)細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)應(yīng)激的耐受能力，提高細(xì)胞存活率，是一種重要的細(xì)胞質(zhì)分子伴侶保護(hù)蛋白[7]。急性和慢性熱應(yīng)激均能上調(diào)蛋雞心臟和肝臟組織HSP70 mRNA表達(dá)水平[8]，熱應(yīng)激能提升雞肝臟基因表達(dá)譜中HSP70基因表達(dá)豐度[9]，急性噪聲應(yīng)激導(dǎo)致肉鴨心臟和肝臟HSP70、HSP90表達(dá)量升高，緩解熱應(yīng)激引起的細(xì)胞損害[2]。本研究中，蛋雞心臟和肝臟組織熱休克蛋白的表達(dá)情況同上述研究結(jié)果基本一致。心臟和肝臟組織HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著溫度升高而增加，熱休克蛋白表達(dá)量和溫度呈一定程度正相關(guān)。在正常飼養(yǎng)條件下，肝臟HSP70 mRNA表達(dá)量是心臟的3.39倍，熱應(yīng)激后2種組織HSP70 mRNA表達(dá)量相差2.87倍。HSP70高表達(dá)有利于蛋白質(zhì)維持正常構(gòu)象，保持細(xì)胞功能，提高對(duì)外界不良刺激的抵抗能力[9]。

細(xì)胞凋亡受到促凋亡信號(hào)通路與抗凋亡信號(hào)通路的雙重調(diào)控。細(xì)胞促凋亡信號(hào)通路分為由線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和由死亡受體介導(dǎo)的外源細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[10]。細(xì)胞色素C氧化酶基因、腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)因子配體分別為線粒體介導(dǎo)與死亡受體介導(dǎo)的促凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因，應(yīng)激活化蛋白激酶基因在細(xì)胞促凋亡信號(hào)通路上游基因，這3個(gè)基因的高表達(dá)都有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。本研究中，隨著溫度升高，肝臟細(xì)胞中HSP70高表達(dá)，導(dǎo)致CCO、TRAIL和SAPK基因表達(dá)水平顯著下降，抑制細(xì)胞凋亡。過(guò)量HSP70與Bax結(jié)合，導(dǎo)致遷移至線粒體的Bax減少，抑制了細(xì)胞色素C的釋放，引起下游半胱氨酸蛋白酶(Caspase)失活，通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡[11]。HSP70蛋白過(guò)表達(dá)，與TRAIL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合成TRAIL-R1，導(dǎo)致死亡信號(hào)復(fù)合體解離，抑制Caspase-8活性，通過(guò)死亡受體介導(dǎo)的外源細(xì)胞凋亡信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡[12]。HSP70還通過(guò)抑制應(yīng)激活化蛋白激酶表達(dá)，在細(xì)胞促凋亡信號(hào)通路上游發(fā)揮作用抑制細(xì)胞凋亡[13]。HSP70作為多種激酶分子伴侶，與PKB及伴侶分子Cdc37形成復(fù)合體，活化PKB功能，通過(guò)抑制細(xì)胞抗凋亡信號(hào)通路保護(hù)細(xì)胞免受損傷[14]。綜上所述，高溫環(huán)境能引起蛋雞心臟和肝臟組織HSP70過(guò)量表達(dá)，影響CCO、TRAIL等細(xì)胞凋亡信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過(guò)程，對(duì)蛋雞機(jī)體細(xì)胞功能有重要作用，嚴(yán)重影響蛋雞生產(chǎn)性能。保持適宜飼養(yǎng)溫度對(duì)維持蛋雞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，保持高產(chǎn)性能具有重要的作用，為在生產(chǎn)中采取精準(zhǔn)措施防控?zé)釕?yīng)激、保障動(dòng)物福利提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。