劉園園 鄧國英 王秋根

201620 上海市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷中心(劉園園、鄧國英、王秋根)；200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(劉園園)

瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)超家族包含超過30個(gè)陽離子通道，廣泛分布于體內(nèi)各個(gè)組織器官中。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)28種哺乳動物TRP通道蛋白亞基，基于氨基酸的同源性將這些基因及其產(chǎn)物分為6個(gè)主要家族，包括TRPC(經(jīng)典)、TRPM(melastatin)、TRPV(香草素)、TRPA(錨蛋白)、TRPP(多囊蛋白)和TRPML(粘蛋白)[1]。TRP和TRP樣(TRP-like，TRPL)通道被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的特異性靶標(biāo)，而氧化應(yīng)激在各種病理生理過程中均起關(guān)鍵作用，可引起包括缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷在內(nèi)的一系列組織損傷[2]。其中，TRPM家族在C末端共享一個(gè)高卷曲螺旋特征區(qū)域而呈現(xiàn)出特殊的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，被認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激和I/R損傷有著密切關(guān)系。已有文獻(xiàn)報(bào)道了TRPM2通道在I/R損傷中具有多重作用，因此，本文著重就近年來對其的研究進(jìn)展展開綜述，并簡述其他一些TRPM成員在I/R損傷中的研究發(fā)現(xiàn)。

1 TRPM通道概述

TRPM通道有4個(gè)已知的亞家族：TRPM1/3、TRPM2/8、TRPM4/5和TRPM6/7。這些通道對Ca2+和Mg2+的通透性不盡相同，例如TRPM4/5對Ca2+不通透，但TRPM6/7對Ca2+和Mg2+高度通[1， 3-4](圖1)。

TRPM通道主要由6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(TM1～6)組成，類似于電壓門控通道的成孔亞單位結(jié)構(gòu)，通道孔位于TM5和TM6之間，該通道可通過形成異源或同源四聚體來參與機(jī)體生理功能的調(diào)節(jié)[2]。TRPM蛋白的N末端部分通常比TRPC和TRPV家族中的相同區(qū)域長約300～400個(gè)氨基酸，可能與TRPM家族通道的自組裝和運(yùn)輸有關(guān)；C末端為高卷曲螺旋特征區(qū)域，顯示出高度可變性，可能與離子通道多聚化或調(diào)節(jié)蛋白的募集有關(guān)。

TRPM1：可通過釋放谷氨酸(Glutamate)與視網(wǎng)膜ON-雙極細(xì)胞的代謝型谷氨酸受體6(MGluR6)結(jié)合，激活異三聚體G蛋白亞基(Goα和Gβγ)并導(dǎo)致TRPM1通道閉合，從而防止Na+和Ca2 +內(nèi)流；TRPM2：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)血管生成，激活活性氧(ROS)，進(jìn)一步釋放二磷酸腺苷-核糖并激活TRPM2，從而允許Ca 2+內(nèi)流，該通道具有熱敏感性；TRPM3：由類固醇孕烯醇酮硫酸鹽(PS)激活，允許Ca2+離子流入；TRPM4：通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而活化，僅允許一價(jià)離子(如K+和Na+)內(nèi)流；TRPM5：另一種通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而活化的單價(jià)陽離子選擇性通道，允許Na+、K+和Cs+內(nèi)流；TRPM6：一種允許Mg2+和Ca2+內(nèi)流的TRP通道激酶，通過耗盡Mg2+或使自身富含的Ser/Thr結(jié)構(gòu)域磷酸化來激活通道；TRPM7：另一種允許Mg2+或Ca2+內(nèi)流的TRP通道激酶；TRPM8：對增加的細(xì)胞內(nèi)pH水平敏感，并且允許Ca2+、Na+和K+通過，可由低溫和化學(xué)冷卻化合物(如薄荷醇和桉葉素)激活圖1 TRPM通道的正常生理功能及其影響因素[3]

2 TRPM通道的激活

TRPM2、TRPM6和TRPM7的C末端區(qū)域具有獨(dú)特的酶結(jié)構(gòu)域。TRPM2通道具有類似于Nudix水解酶的酶促結(jié)構(gòu)域，可切割單/雙核苷酸多磷酸，而TRPM6和TRPM7通道含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，被歸類為非典型α蛋白激酶[5]。

2.1 TRPM2

TRPM2胞質(zhì)C末端獨(dú)特的NudT9-H結(jié)構(gòu)域提供與ADP-核糖(ADP-ribose，ADPR)結(jié)合的位點(diǎn)，直接參與ADPR誘導(dǎo)的TRPM2激活[6]。實(shí)際上，TRPM2對活性氧(reactive oxygen species，ROS)的敏感性高于其他TRP，例如通過半胱氨酸修飾由氧化劑直接激活的TRPC5、TRPV1和TRPA1[7]。

除了ADPR之外，一些與ADPR代謝相關(guān)的其他腺嘌呤核苷酸第二信使具有激活TRPM2的能力，包括環(huán)狀A(yù)DPR、煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，但TRPM2是否可以通過這些分子被直接激活尚不清楚。2’-O-乙酰基-ADP-核糖、沉默信息調(diào)節(jié)因子2均可直接結(jié)合NudT9-H激活TRPM2[8]。

ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以說是TRPM2最重要的激活劑。在線粒體中，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)NAD+水解產(chǎn)生ADPR，通過在NudT9-H序列中激活A(yù)DPR焦磷酸酶來激活TRPM2通道。在細(xì)胞核中，聚(ADP-核糖)聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]可修復(fù)氧化應(yīng)激中的DNA損傷，PARP-1與損傷DNA的結(jié)合可水解NAD+產(chǎn)生煙酰胺和ADPR[6， 9]。NAD+和PARP激活TRPM2可進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體內(nèi)鈉鈣超載，致細(xì)胞死亡。抑制TRPM2或PARP活性僅可部分抑制細(xì)胞死亡，而二者的抑制可完全阻止超微結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞死亡[6]。新近研究還發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可激活TRPM2-Ca2+-CaMKⅡ信號級聯(lián)通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，構(gòu)成正反饋環(huán)，從而抑制自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[10]。

2.2 TRPM7

TRPM7是目前唯一已知的對細(xì)胞生存能力至關(guān)重要的離子通道，其功能主要是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Mg2+和Mg·ATP復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)的。Mg2+不僅對TRPM6和TRPM7都有抑制作用，還可激活TRPM7激酶的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性[11]。研究認(rèn)為，這類通道激酶的異構(gòu)化會引起相關(guān)通道的生理學(xué)和藥理學(xué)改變。比如TRPM7和TRPM6具有在C末端高度同源的Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域，因此二者在TRPM7激酶的作用下，易發(fā)生交叉磷酸化，形成TRPM7/M6異聚體，成為更高效的二價(jià)離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道[5， 12]。

3 I/R條件下ROS的產(chǎn)生

I/R損傷是由缺血期間缺氧后再灌注期間的再氧合引起的，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜，多年來研究主要集中于氧自由基產(chǎn)生、鈣超載和炎癥反應(yīng)[3]。

I/R期間，氧化劑和抗氧化劑之間的平衡失調(diào)引起的氧化應(yīng)激是引起組織損傷的重要因素，其嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間決定了損傷程度[14]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基中間體包括ROS和活性氮，它們通過蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化、亞硝基化和DNA氧化和誘變損傷細(xì)胞[13]。內(nèi)源性氧化應(yīng)激的最初步驟通常是形成ROS超氧化物，然后轉(zhuǎn)化為過氧化氫和羥基自由基[15]。

再灌注期間，ROS可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(包括上調(diào)Fas/Fas配體)激活外在細(xì)胞死亡途徑，并通過調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔激活線粒體細(xì)胞死亡途徑[14]。后者主要通過電壓依賴性鈣通道和Na+-Ca2+交換等多種機(jī)制介導(dǎo)Ca2+大量內(nèi)流，激活通透性轉(zhuǎn)換孔阻止ATP產(chǎn)生，使細(xì)胞色素C大量釋放至胞質(zhì)溶膠中，與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合，形成凋亡體，激活caspase 9、3和7，使PARP失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但細(xì)胞的壞死并不依賴于caspase3，而是由于高濃度的ROS誘導(dǎo)PARP活化和[ATP]i/NAD+耗竭，引起膜透化[16]。

NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)有助于ROS的生成。NOXs共有6個(gè)亞型，多存在于吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上，可促進(jìn)殺死微生物的ROS產(chǎn)生，而Nox2和Nox4亞型多為內(nèi)皮細(xì)胞ROS的主要來源，通過多種信號通路啟動炎癥反應(yīng)，減少相關(guān)抗氧化酶水平，損傷組織細(xì)胞，加速細(xì)胞凋亡[17-18]。NOX的表達(dá)可受缺氧誘導(dǎo)因子1α的調(diào)節(jié)，因此，I/R缺氧期間可導(dǎo)致NOX同種型的表達(dá)上調(diào)，再灌注時(shí)NOX相應(yīng)產(chǎn)生大量ROS[19]。此外，缺血期間ATP大量消耗，黃嘌呤氧化酶參與兩步催化，這一過程也會發(fā)生電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生超氧陰離子[6]。

4 TRPM2通道在不同組織器官I/R損傷中的多重作用

過去ROS被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷的非特異性毒素，后來ROS被證實(shí)為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[2]。而Ca2+對神經(jīng)元細(xì)胞既有保護(hù)作用也有傷害作用，影響著包括基因表達(dá)、神經(jīng)元生長、神經(jīng)遞質(zhì)釋放及細(xì)胞壞死、凋亡在內(nèi)的廣泛生物效應(yīng)[10]?，F(xiàn)已有多項(xiàng)研究表明，TRPM2通道可促進(jìn)ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與Ca2+之間的信號轉(zhuǎn)化。以下就TRPM2的這種轉(zhuǎn)化在不同組織器官I/R損傷中的作用展開詳細(xì)闡述。

4.1 腦

腦缺血和脊髓損傷后，大量ROS的釋放和PARP-1的過度產(chǎn)生最終導(dǎo)致線粒體功能障礙、凋亡誘導(dǎo)因子釋放和細(xì)胞死亡[20]。

無論是體外通過氧和葡萄糖剝奪再氧合(oxygen and glucose deprivation，OGD)模型模擬體內(nèi)I/R損傷，還是體內(nèi)短暫的大腦中動脈閉塞模型誘導(dǎo)腦I/R損傷，TRPM2通道均會使Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[21]。不過，這種細(xì)胞死亡與性別相關(guān)，用克霉唑、特異性抑制劑tat-M2NX或基因敲除抑制TRPM2通道可減少男性的缺血性損傷，但不能降低女性的缺血性損傷[22-23]。這可能是雄激素在I/R期間促進(jìn)了TRPM2依賴性腦損傷[21]，并且有學(xué)者認(rèn)為可能是雄激素刺激產(chǎn)生了TRPM2參與雄性大腦缺血性損傷所必須的PARP-1[24]。

Alim等[25]發(fā)現(xiàn)，NMDA-R(含有GluN2A亞基)可激活TRPM2 KO小鼠體內(nèi)ERK/AKT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞存活機(jī)制。同時(shí)，在OGD模型中還發(fā)現(xiàn)GluN2A拮抗劑的應(yīng)用消除了從TRPM2 KO小鼠胚胎分離的海馬神經(jīng)元中的神經(jīng)保護(hù)作用，這意味著破壞TRPM2通道增加GluN2A可保護(hù)神經(jīng)元免受I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

通過敲除TRPM2通道，不僅證實(shí)了其體外的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步還有實(shí)驗(yàn)證明缺乏TRPM2通道是外周血免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性表型的重要原因。Gelderblom等[26]發(fā)現(xiàn)對于腦卒中患者，TRPM2主要通過激活外周免疫細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)影響免疫細(xì)胞遷移，從而損傷腦組織。

新近研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外I/R模型中，TRPM2的激活在再灌注期間[Zn2+]c和CA1錐體神經(jīng)元死亡的延遲增加中的關(guān)鍵作用，可繼發(fā)缺血后記憶障礙，并將TRPM2鑒定為向缺血后腦損傷發(fā)出ROS信號的關(guān)鍵分子[27]。總之，目前為止的體內(nèi)和體外證據(jù)一致表明，TRPM2在腦缺血中是有害的。

4.2 心臟

TRPM2通道在心肌I/R損傷中的作用目前還存在很多爭論。一些研究認(rèn)為TRPM2通道會在氧化應(yīng)激的刺激下導(dǎo)致線粒體功能障礙，惡化心肌的I/R損傷[8]。Hiroi等[28]發(fā)現(xiàn)，盡管在心臟中可觀察到TRPM2 mRNA表達(dá)，但其水平顯著低于中性粒細(xì)胞或神經(jīng)元中的水平。更重要的是，中性粒細(xì)胞活化和浸潤是再灌注損傷的標(biāo)志，且TRPM2通道表達(dá)于中性粒細(xì)胞而非心臟。因此，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明再灌注期間，中性粒細(xì)胞中TRPM2的激活可能通過心臟中性粒細(xì)胞的累積而在心肌梗死中起關(guān)鍵作用。

然而，近年來不少研究發(fā)現(xiàn)TRPM2可以保護(hù)心臟防止I/R損傷。Miller等[29]發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈閉塞后再灌注對梗死面積無顯著影響，但會使心臟功能受損，表現(xiàn)為TRMP2 KO小鼠的ROS水平顯著高于WT小鼠，其中超氧化物歧化酶及其轉(zhuǎn)錄因子和低氧誘導(dǎo)因子的水平較低，而NADPH氧化酶催化亞基NOX4的水平較高。此外，線粒體蛋白和復(fù)合物Ⅰ亞基在TRMP2 KO小鼠心臟中下調(diào)。TRPM2 KO小鼠心臟中ROS的過量產(chǎn)生和線粒體功能障礙引發(fā)的蛋白質(zhì)表達(dá)，可能是心臟功能障礙的原因[30]。換言之，TRPM2可通過恢復(fù)線粒體功能，降低線粒體ROS產(chǎn)生，同時(shí)增加氧化應(yīng)激細(xì)胞中ROS清除，來保護(hù)心臟免受I/R損傷[13， 31]。

4.3 腎

在腎臟中，TRPM2通道多表達(dá)于腎臟近端小管中，它被認(rèn)為會加劇腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)和ROS的產(chǎn)生，破壞TRPM2通道反而可保護(hù)腎臟免受RIRI，考慮可能是因TRPM2通道存在于實(shí)質(zhì)細(xì)胞而非造血細(xì)胞中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TRPM2通道引起的Ca2+內(nèi)流可參與Rac1蛋白的活化，而后者作為小G蛋白家族的重要成員之一，是激活NOX的必需因子，可將NOX募集至質(zhì)膜，增加ROS產(chǎn)生并導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。因此，在WT小鼠中會發(fā)生伴隨NOX活化的氧化應(yīng)激，而在TRMP2 KO小鼠中可有效減少缺血性腎損傷[32]。

5 TRPM7在I/R損傷中的作用

對TRPM7作用機(jī)制的研究雖未完全明朗，但近年來也有一些研究發(fā)現(xiàn)了其在I/R損傷中的作用。TRPM7的表達(dá)主要發(fā)生在RIRI早期的腎小管中，會引起鈣鎂離子減少，抑制MAPKs細(xì)胞信號通路的活性。因此，抑制腎皮質(zhì)TRPM7可減輕小鼠移植引起的腎損傷[33]。最新研究表明，已合成的一種代謝更為穩(wěn)定的新型硫醚環(huán)狀螺旋B肽(cyclic helix B peptide，CHBP)是促紅細(xì)胞生成素的衍生物，在沒有紅細(xì)胞的情況下仍有組織保護(hù)功能，但是TRPM7活化部分阻斷了I/R相關(guān)損傷后CHBP誘導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用。這就意味著TRPM7不僅參與腎I/R損傷，還參與CHBP誘導(dǎo)的腎臟保護(hù)作用，并提出TRPM7可能是I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷的診斷和干預(yù)的潛在生物標(biāo)記物[34]。

6 展望

在本文中，我們詳細(xì)闡述了對I/R損傷有作用的相關(guān)TRPM通道。其中TRPM2對腦、腎的I/R損傷有顯著惡化作用，但是作為ROS和Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的連接，TRPM2在心臟的I/R損傷中起著雙重作用，不僅可以通過鈣超載引起細(xì)胞死亡，也可通過降低線粒體ROS產(chǎn)生和增加氧化應(yīng)激細(xì)胞中的ROS清除，恢復(fù)線粒體功能而使心臟免受I/R損傷。

現(xiàn)在雖已報(bào)道了一些非特異性TRPM2抑制劑(如PARP抑制劑、克霉唑和2-APB)可減輕ROS引起的疾病惡化[6]，但如果可以在對ROS敏感性TRP通道進(jìn)行靶向治療的基礎(chǔ)上，找到其他如TRPM7一般或是更具特異性的TRP通道，作為潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行早期監(jiān)測和干預(yù)，可能會為I/R損傷和氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病的預(yù)防和治療另辟新的道路。

利益沖突：無