吳俏鋒，周賓賓，魏衛(wèi)兵，覃鏡羽，馮振奮，李建男

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧市 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧市 530023

脊髓損傷具有致殘率高、康復(fù)難和病程長的特點(diǎn)，治療和康復(fù)產(chǎn)生的高費(fèi)用為患者家庭帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。如何促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及突觸再生為近年來的研究熱點(diǎn)[1]。

中醫(yī)在脊髓損傷的康復(fù)和治療中有著獨(dú)到的優(yōu)勢，其中針灸基于深厚的經(jīng)絡(luò)理論，在促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)及緩解并發(fā)癥上有著可觀的效果[2-4]。由于脊髓的解剖位置和功能與中醫(yī)督脈高度相似，現(xiàn)代中醫(yī)臨床有“脊柱損傷即督脈損傷”之說[5]。脊髓損傷后其損傷平面以下運(yùn)動神經(jīng)功能障礙的癥狀，可歸于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“痿癥”的范疇?；凇秲?nèi)經(jīng)》“治痿獨(dú)取陽明”的理論，臨床對于脊髓損傷的針灸研究多為陽明經(jīng)穴干預(yù)實(shí)踐，但缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

Synapsin I 作為只存在于突觸前囊泡膜上的特異性蛋白，對囊泡運(yùn)輸、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸的可塑性具有重要的意義[6-7]，其分布和表達(dá)可反映神經(jīng)元突觸的功能[8-9]。

本研究擬建立缺血損傷型大鼠脊髓損傷模型，通過BBB評分評價不同時間點(diǎn)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能情況，比較電針夾脊穴和足陽明胃經(jīng)對脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并檢測不同時間點(diǎn)脊髓損傷部位Synapsin I 的mRNA 和蛋白水平，以驗(yàn)證“治痿獨(dú)取陽明”。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年雌性SPF 級Sprague-Dawley 大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXKX-2014-0002。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要儀器和試劑

SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)：碧云天，貨號P0015L。PMSF：碧云天，貨號ST506。RIPE 蛋白裂解液：索萊寶，貨號R0020。Trizol：大連寶生物，貨號9109。SYBR Green mix：南京諾維贊，貨號Q111-01。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：FERMENTAS 公司，貨號K1622。Synapsin I一抗：博士德生物，貨號BA1421，75 kDa。Tanon-4200 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)。電泳儀：北京六一。半干轉(zhuǎn)膜儀：日本ATTO。ABI7500熒光定量PCR儀。

1.3 造模

根據(jù)課題組前期研究的結(jié)果[10-12]，采用缺血損傷型造模方法，對實(shí)驗(yàn)大鼠T10椎板切除后采用血管鉗鉗夾脊髓的方法進(jìn)行造模。10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后術(shù)區(qū)備皮，俯臥位固定于手術(shù)臺上，術(shù)區(qū)碘伏常規(guī)消毒。以T10棘突為中心切開皮膚約3 cm，分離皮下筋膜及椎旁肌肉，暴露T9～T11棘突及椎板，修剪棘間韌帶，用眼科鑷夾持T10棘突輕輕上提，擴(kuò)大T10～T11椎體間隙后，以12 cm 持針器經(jīng)擴(kuò)大的椎體間隙與脊髓平行咬除椎板，暴露硬脊膜。用血管夾(夾力約60 g)穿過脊髓椎體之間，鉗夾脊髓30 s 導(dǎo)致T10脊髓缺血損傷。輕柔打開抽出血管夾，溫鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、筋膜及皮膚。術(shù)后前3 d 每天皮下注射20 萬U 青霉素鈉預(yù)防感染，每日定期膀胱壓迫排尿2次。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：①閉合血管夾后脊髓表面迅速滲出暗紅色血液，同時可見下肢抽搐及尾巴左右擺動；②術(shù)后第1 天可見大鼠雙下肢功能完全喪失，肌力0級，雙下肢拖行移動，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分[13]均為0。

1.4 分組

造模成功后，將每只大鼠編號，根據(jù)Excel 生成的隨機(jī)號碼分為對照組、夾脊穴電針組(夾脊組)和足陽明胃經(jīng)電針組(陽明組)，每組20 只，均于造模成功3 d 后開始干預(yù)。分別于干預(yù)后第1 周、2 周、3 周、4周和5 周結(jié)束時取材，每個時間點(diǎn)4 只大鼠。自干預(yù)起，每天按BBB評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行行為功能評估并記錄。

1.5 干預(yù)

參照全國針灸協(xié)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的《實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜》，選穴方法：①對照組造模后不做干預(yù)；②夾脊組選取后背T9和T11椎體棘突平面夾脊穴；③陽明組選擇雙側(cè)伏兔、足三里穴。

以上每個穴位各刺入一根毫針，穿皮后再進(jìn)針約2 mm，刺激強(qiáng)度12～15 mV(C6805-I 型電針治療儀)，刺激頻率2 Hz，疏密波，留針30 min。工作日每天1次，連續(xù)5周。

1.6 灌注、固定和樣本采集

每組大鼠于相應(yīng)干預(yù)時間，以10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射，麻醉后固定于手術(shù)臺上，用手術(shù)剪剪開胸腔暴露心臟，于心間處穿入灌胃針至升主動脈，并用止血鉗將灌胃針與心尖固定，剪開右心耳后，0.9%氯化鈉溶液灌注至大鼠眼睛、肝臟等顏色變淡，且右心耳流出液體清徹。

每個亞組取1 只大鼠4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注，待大鼠四肢、尾部和軀干僵硬后停止。處死后用手術(shù)剪分離出損傷部分脊柱，小心取出以損傷點(diǎn)為中心長約1 cm 的脊髓組織，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行病理切片用于HE 染色和免疫組化染色。每個亞組剩余3 只大鼠取損傷脊髓標(biāo)本保存于液氮中，用于行Western blotting 和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)。

1.7 檢測

取1 份標(biāo)本石蠟包埋后，切成5 μm 的石蠟切片，50 ℃溫水中展片、貼片后，放于60 ℃恒溫箱內(nèi)烤片2 h備用。

1.7.1 HE染色

取上述標(biāo)本經(jīng)過蘇木素染色5 min；鹽酸乙醇分化5 s；自來水返藍(lán)15 min；伊紅染色5 min；95%乙醇快速清洗2 min，共2次；無水乙醇快速脫水；二甲苯透明5 min，共3次；樹膠封片；鏡檢拍照。

1.7.2 免疫組化染色

取上述標(biāo)本經(jīng)過檸檬酸鈉高壓抗壓修復(fù)，3%H2O2溶液室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，滴加Synapsin I 多克隆抗體工作液，Synapsin I 抗體稀釋液(稀釋濃度1∶85)50 μl，置于濕盒中孵育2 h；室溫下滴加二抗，DAB 顯色，顯微鏡下觀察，陽性顯色為棕黃色、棕色或棕褐色；經(jīng)復(fù)染、脫色、反藍(lán)、脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察。

Synapsin I 染色以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，染色結(jié)果根據(jù)免疫組化半定量評分標(biāo)準(zhǔn)[14]。高倍鏡(×400)下對每張切片任意選5 個視野，計數(shù)200個細(xì)胞/視野，共計1000個細(xì)胞，觀察其陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度。A 為陽性細(xì)胞數(shù)分級，0%～1%=0，1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4；B 為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級，陰性=0，弱陽性=1，陽性=2，強(qiáng)陽性=3。免疫組化評分(immunohistochemical scores,IHS)=A×B[14]。

1.7.3 RT-qPCR

取上述液氮保存組織(每份標(biāo)本50～100 mg)，用Trizol 提取總RNA，紫外分析測定所抽提RNA 的濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量PCR 儀進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增與檢測，反應(yīng)條件：95 ℃120 s，循環(huán)40 次，95 ℃15，60 ℃20 s，72 ℃20 s。

設(shè)計合成Synapsin I 引物序列：上游引物5′-GAT GGT TCG ACT ACA CAA-3′，下游引物3′-TCT TCA CAA CTA CAG GGT-5′(擴(kuò)增片段長度116 bp)。

ATCB 內(nèi)參序列：上游引物5′-GCT ATG TTG CCC TAG ACT TCG A-3′，下 游 引 物3′-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-CC-5′(擴(kuò)增片段長度173 bp)。

反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 10μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 5 μl，超純水4 μl，采用△△Ct 法進(jìn)行基因表達(dá)的相對定量。

1.7.4 Western blotting

取上述液氮保存的標(biāo)本，用RIPE 裂解液提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，上樣后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加1∶400 Synapsin I 蛋白稀釋抗體4 ℃孵育過夜，次日用含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液稀釋二抗(1∶3000)，室溫孵育后，曝光并拍照記錄。用軟件分析圖像，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，以Synapsin I 蛋白與內(nèi)參的比值作為相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量結(jié)果以(xˉ±s)表示。多樣本間比較用單因素方差分析，方差齊性時，采用LSD檢驗(yàn)；方差不齊時，采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

夾脊組和陽明組術(shù)后1～5 周BBB 評分均高于對照組(P<0.05)。陽明組1～3 周BBB 評分高于夾脊組(P<0.05)，4～5 周兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 HE染色

對照組1～2周時脊髓結(jié)構(gòu)極度紊亂，神經(jīng)元消失，部分髓鞘脫失，中度炎細(xì)胞浸潤；隨著時間延長逐漸好轉(zhuǎn)；5 周時脊髓結(jié)構(gòu)輕微紊亂，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，無髓鞘脫失，偶有炎細(xì)胞浸潤，無明顯出血。陽明組1 周時脊髓灰質(zhì)區(qū)中度炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管數(shù)量增多，結(jié)構(gòu)稍紊亂；后逐漸好轉(zhuǎn)，5 周時可見炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。夾脊組1周時脊髓灰質(zhì)區(qū)中度炎細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管數(shù)量增多，有輕微出血，有少量脂肪滴脊髓結(jié)構(gòu)稍紊亂；后逐漸好轉(zhuǎn)，5 周時可見輕度炎細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元數(shù)量增多。見圖1。

2.3 免疫組化染色

Synapsin I 蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)，第1 周起，蛋白陽性表達(dá)逐漸增強(qiáng)；第3 周時，陽性表達(dá)最高；從4周開始，陽性表達(dá)逐漸降低。見圖2。

夾脊組1 周時Synapsin I 蛋白IHS 高于對照組(P<0.05)，陽明組1～4 周均高于對照組(P<0.05)。陽明組3～4周時SynapsinI蛋白IHS高于夾脊組(P<0.05)。見表2。

2.4 RT-qPCR

對照組Synapsin I mRNA 表達(dá)隨著時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，4周時達(dá)到高峰，5周開始降低。夾脊組1 周時Synapsin I mRNA 表達(dá)高于對照組(P<0.05)，陽明組1～4 周均高于對照組(P<0.05)。陽明組3 周時Synapsin I mRNA 表達(dá)高于夾脊組(P<0.05)。見表3。

表1 各組不同時間點(diǎn)BBB評分比較

表2 各組Synapsin I蛋白IHS比較

圖1 各組脊髓形態(tài)(HE染色，×400)

圖2 各組Synapsin I蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×400)

表3 各組Synapsin I mRNA表達(dá)(△△Ct)

2.5 Western blotting

對照組Synapsin I 蛋白隨著時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在3 周時達(dá)到高峰，3 周后逐漸降低。夾脊組1周時Synapsin I蛋白表達(dá)高于對照組，陽明組1～4 周時均高于對照組(P<0.05)。陽明組Synapsin I蛋白表達(dá)2～3周高于夾脊組。見圖3、表4。

3 討論

脊髓損傷后早期手術(shù)能有效緩解繼發(fā)性損傷[15]，中后期則是漫長的康復(fù)治療。針灸作為中醫(yī)特色療法之一，具有促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)、緩解并發(fā)癥等獨(dú)特的優(yōu)勢[16]。臨床上治療脊髓損傷選穴主要以督脈和足陽明胃經(jīng)為主，然而對于脊髓損傷電針干預(yù)的動物實(shí)驗(yàn)研究多為督脈或夾脊穴。

圖3 各組脊髓損傷部位Synapsin I蛋白條帶圖(Western blotting)

表4 各組Synapsin I蛋白表達(dá)(/β-actin)

鄒恩苗等[17]對48 只Sprague-Dawley 大鼠電針督脈和夾脊穴后觀察7 d，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-lβ、IL-6 下調(diào)，IL-10 上調(diào)。李曉寧等[18]發(fā)現(xiàn)電針夾脊穴能夠改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能，可能與抑制NLRP3 炎癥小體過度活化、降低caspase-1 表達(dá)有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)[19]，電針夾脊穴可抑制損傷局部Ras 同源基因Rho 相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶(Ras homologous gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase,Rho-ROCK)Ⅱ信號通路RhoA、ROCKⅡ、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)的表達(dá)。劉鵬民等[20]觀察到督脈電針具有上調(diào)生長相關(guān)蛋白(growth associated protein,GAP)-43、抑制Nogo-A 的作用。Tu等[3]發(fā)現(xiàn)督脈電針可以上調(diào)損傷局部脊髓腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin-3,NT-3)的水平，且跨損傷部位的大椎、命門穴電針效果較損傷截面以上的百會、風(fēng)府穴要好。Mo 等[21]更是觀察到神經(jīng)元數(shù)量增多的現(xiàn)象。

可見基于“督脈論治脊髓”理論，電針督脈或夾脊穴對脊髓損傷大鼠下肢神經(jīng)功能恢復(fù)具有促進(jìn)的作用，同時還兼具減輕炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)突觸再生、緩解脊髓損傷并發(fā)癥等眾多效果。

然而中醫(yī)素有“同病異治”的觀點(diǎn)，脊髓損傷表現(xiàn)為下肢運(yùn)動功能障礙，可歸屬于中醫(yī)“痿癥”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》有“治痿獨(dú)取陽明”的理論詮釋，但是缺乏實(shí)驗(yàn)研究證明?！端貑枴ゐ粽摗分小瓣柮髡撸迮K六腑之?！柮鳛橹L，皆屬于帶脈，而絡(luò)于督脈，故陽明虛則宗筋骨縱，帶脈不引，故足不用也”也闡述了足陽明胃經(jīng)與督脈和痿癥的關(guān)系?；诖死碚?，夏士濤等[22]電針足陽明胃經(jīng)治療脊髓損傷也取得較好的效果。

本實(shí)驗(yàn)觀察對比電針夾脊穴和足陽明胃經(jīng)穴對脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的影響。選擇足三里作為足陽明胃經(jīng)合穴，具有遠(yuǎn)治調(diào)理脾胃，補(bǔ)益氣血的功效，符合“治痿獨(dú)取陽明”的理論要求，伏兔同屬足陽明胃經(jīng)，為臨床治療下肢癱瘓的常用穴，故選為配穴?！度A佗別傳》“又有人病腳躄不能行，……后灸愈。灸處夾脊一寸上下行，端直均調(diào)如引繩也”指出夾脊穴對于下肢功能障礙的治療作用，選取損傷部位附近夾脊穴作為本實(shí)驗(yàn)研究對象主要取其近治行氣活血的功效[17-18]。

Synapsin I 最早被發(fā)現(xiàn)于1985 年，是一種與神經(jīng)生長、修復(fù)再生和突觸重塑密切相關(guān)的Ca2+敏感蛋白[23]，廣泛存在于突觸前膜中，其水平被認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)元之間突觸強(qiáng)度的重要指標(biāo)而應(yīng)用于神經(jīng)功能研究中[9]。其對突觸小泡的作用在于去磷酸化的狀態(tài)下與突觸小泡結(jié)合，磷酸化后從囊泡中解離，最終允許神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐作用[24]。而神經(jīng)遞質(zhì)作為突觸間傳遞的主要介質(zhì)，Synapsin I 蛋白可反映突觸胞吐的能力[25-26]。另有研究表明[27-28]，Synapsin I 在分布和數(shù)量上與突觸的數(shù)量和密度具有相關(guān)性，可作為觀察突觸密度和分布的指標(biāo)。此外，Synapsin I 對于突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)也尤為重要[29]。神經(jīng)再生主要與突觸的重塑有關(guān)，因此，Synapsin I 的表達(dá)量和密度分布等可作為反映神經(jīng)功能的特異標(biāo)志物。

本研究中，脊髓損傷后所有大鼠均出現(xiàn)典型的雙后肢癱瘓，術(shù)后10 d 大鼠的后肢運(yùn)動功能逐漸開始有不同程度的改善，電針干預(yù)對后肢運(yùn)動功能恢復(fù)作用明顯，BBB 評分要優(yōu)于對照組。對照組BBB 評分在經(jīng)過一段低水平分值后開始逐漸上升，夾脊組1 周即出現(xiàn)神經(jīng)功能改善，陽明組改善更佳。RT-qPCR 結(jié)果顯示，術(shù)后Synapsin I mRNA表達(dá)先上升后下降，4周時達(dá)到高峰。夾脊組Synapsin I mRNA 表達(dá)總體高于對照組，但是只有1 周時有顯著性差異，陽明組1～4周均優(yōu)于對照組。Western blotting 結(jié)果顯示，對照組Synapsin I蛋白改變峰值相對mRNA 提前，3周時就已達(dá)到高峰，改變趨勢接近BBB評分，可能與脊髓損傷后早期局部炎癥、缺血條件未能得到改善，神經(jīng)元代謝和蛋白降解功能受影響有關(guān)[30]。HE 染色也可見3周后炎性細(xì)胞浸潤改善；夾脊組Synapsin I 蛋白水平提高，但是只有1 周時有顯著性差異，陽明組1～4 周均優(yōu)于對照組。另有研究表明，大鼠脊髓損傷后輔助運(yùn)動或自由運(yùn)動均對脊髓損傷康復(fù)具有促進(jìn)作用[31-32]，本研究中陽明組電針時也可見大鼠雙下肢肌肉收縮，可能由于此原因，Synapsin I蛋白量5周時組間無顯著性差異。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，經(jīng)過缺血損傷型造模后，脊髓損傷大鼠下肢神經(jīng)功能具有可逆自行恢復(fù)的現(xiàn)象。電針夾脊穴和足陽明胃經(jīng)可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠下肢神經(jīng)功能的恢復(fù)，體現(xiàn)電針的促進(jìn)修復(fù)效能和“治痿獨(dú)取陽明”的微弱優(yōu)勢，同時也顯現(xiàn)了中醫(yī)“同病異治”的臨床特點(diǎn)。

本文作為電針足陽明胃經(jīng)對脊髓損傷后神經(jīng)康復(fù)的初步探索，為臨床治療脊髓損傷選穴提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但由于實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)不多或存其他調(diào)控及偏倚原因，部分?jǐn)?shù)據(jù)未能體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異，HE 染色提示的炎癥緩解和神經(jīng)細(xì)胞增多也未能定量比較，有待今后進(jìn)一步研究。電針夾脊穴或督脈治療脊髓損傷已具有多靶點(diǎn)的認(rèn)識[33]，“治痿獨(dú)取陽明”能否擁有更優(yōu)的效果，亦有待進(jìn)一步探討。