潘兆軍, 田兆方, 武 榮

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科, 淮安 223002；2. 淮安市婦幼保健院新生兒醫(yī)學(xué)中心, 淮安 223002)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒胃腸疾病死亡的主要原因，隨著新生兒救治技術(shù)的提高，極低及超低出生體質(zhì)量嬰兒生存率不斷提高，但NEC發(fā)病率及相關(guān)的死亡率并未下降。據(jù)不完全統(tǒng)計，出生體質(zhì)量低于1500 g的早產(chǎn)兒，NEC發(fā)病率在10%左右，死亡率在20%～30%，并且隨著疾病嚴重程度呈上升趨勢[1-3]。到目前為止，NEC的病理生理學(xué)機制仍未完全闡明，但已經(jīng)確定了早產(chǎn)、細菌定植、腸內(nèi)營養(yǎng)和不成熟的免疫系統(tǒng)等幾個危險因素[4]。大多數(shù)現(xiàn)有的NEC動物模型都沒有在實驗中考慮早產(chǎn)因素。剛出生的大鼠腸道隱窩和絨毛發(fā)育相當(dāng)于人類22周的孕齡[5]，而人類NEC多發(fā)生于孕齡低于32周的早產(chǎn)兒，可以模擬人類NEC發(fā)病時期建立充分表征的NEC模型，對探討NEC的發(fā)病機制及有效的預(yù)防治療措施具有重要價值。本實驗在目前相關(guān)研究現(xiàn)狀基礎(chǔ)上，對出生后不同日齡的新生大鼠，通過人工喂養(yǎng)、缺氧、冷刺激及LPS胃內(nèi)注入等方法建立NEC大鼠模型，并對兩者進行比較以探索適宜的NEC模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

妊娠18 d SPF級SD大鼠6只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016], 飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院動物實驗中心[SYXK(蘇)2018-0012]。選取出生2 h及48 h SD大鼠各24只，按體質(zhì)量大小編號，2個時點再隨機分為人工喂養(yǎng)組(A、B組）、人工喂養(yǎng)+脂多糖(LPS)組(C、D組)、對照組(E、F組)，即2 h的A、C、E組及48 h的B、D、F組，每個亞組8只小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

低出生體質(zhì)量嬰兒配方奶粉(超級能恩)購自雀巢公司； 脂肪乳注射液(C6-C24)購自華瑞制藥有限公司； 蛋白質(zhì)粉購自湯臣倍健公司； LPS(E.coli055：B5)購自美國Sigma公司； 胃管由24G靜脈留置針導(dǎo)管改裝； TED-60T測氧儀購自美國Teledyne公司； 保育箱為戴維YP-90A嬰兒保育箱； 缺氧箱由戴維無接觸輸氧頭罩改裝； 37 ℃恒溫水浴箱購自上海醫(yī)療器械廠, 4 ℃冰箱購自青島海爾電器有限公司。

1.3 鼠乳配方奶配置步驟

參照參考文獻[6]稱取早產(chǎn)兒配方奶5 g、蛋白粉8 g，脂肪乳(C6-C24)50 mL，加入約80 ℃滅菌注射用水自100 mL，使用玻璃棒充分混勻，總熱量為617.4 kJ。

1.4 造模流程

A組采用24G靜脈置留置針定時經(jīng)口插管喂養(yǎng)，第1日按0.1 mL/3 h給予，隨后每24 h增加0.05 mL；B組人工喂養(yǎng)第1日按0.15 mL/3 h給予，隨后每24 h增加0.05 mL。C組、D組分別在A組、B組基礎(chǔ)上每日加用LPS 10 mg/kg(2 mg/mL稀釋于滅菌水中)1次，經(jīng)胃內(nèi)注入，連續(xù)3次。LPS灌胃時的配方奶喂養(yǎng)量=需奶量-LPS量-胃殘奶量。E、F組：僅由母鼠母乳喂養(yǎng)。

1.5 缺氧及冷刺激流程

打開缺氧箱中的純氮氣筒流量表，控制氮氣流量為15 L/min, 當(dāng)缺氧箱氧濃度為零時開始計時,置入實驗大鼠，持續(xù)90 s后，隨后將其置入冰箱冷藏室中，保持環(huán)境溫度4 ℃，持續(xù)10 min，結(jié)束后放回保育箱，每12 h進行1次缺氧+冷刺激，共6次。

1.6 處理

觀察大鼠活動情況，所有大鼠試驗前和試驗后同一時間稱重，并進行記錄。所有實驗大鼠均于相應(yīng)實驗時點的84 h空腹斷頭處死大鼠，打開腹腔取出取回盲部近端腸管1 cm置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中固定，取冠狀切面，HE染色，光學(xué)顯微鏡下進行腸道組織病理評分。

1.7 腸道組織病理評分

腸道組織病理評分參考文獻[7]，由不參與本實驗項目的揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院病理科二位中級以上職稱人員進行雙盲法評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分：輕微黏膜下和(或)固有層腫脹分離；2分：中度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫；3分：重度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或) 肌層水腫，局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失伴腸壞死。病理評分≥2分者視為NEC造模成功。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)及存活情況

造模后，A、C組大鼠8～12 h相繼出現(xiàn)不同程度排黃綠色黏液稀便、腹脹、體質(zhì)量減輕，隨后出現(xiàn)胃潴留、嘔吐、嗜睡，常蜷縮而臥、抱團反應(yīng)消失、活動度下降、反應(yīng)遲鈍, 且逐漸加重。B、D組大鼠在實驗開始后12 h內(nèi)即出現(xiàn)主動活動減少，對外界刺激反應(yīng)減緩，均出現(xiàn)不同程度出現(xiàn)腹脹和胃潴留的癥狀, 伴有排黃綠色甚至黑色稀便等大便性狀的改變，并出現(xiàn)生長緩慢或體質(zhì)量不增, 以D組大鼠癥狀為重。造模期內(nèi)A組大鼠死亡2只，C組死亡3只，B、D組各有1只死亡, 6組動物死亡率分別為25%、12.5%、37.5%、12.5%、0、0。E、F組大鼠生長發(fā)育無明顯異常，體質(zhì)量增長穩(wěn)定，主動活動及對外界刺激反應(yīng)良好，進食及排便正常，無消化道異常表現(xiàn)。各組大鼠體質(zhì)量增長情況見表1。

2.3 腸道組織病理學(xué)觀察

早期人工喂養(yǎng)A組(圖1A1、A2)、C組(圖1C1、C2)回盲部腸道組織壞死嚴重，腸壁絨毛大部分脫落壞死，腺體排列紊亂消失，固有層與黏膜下層重度水腫，部分樣本腸絨毛消失伴腸壞死。晚期喂養(yǎng)B組(圖1B1、B2)、D組(圖1D1、D2)腸黏膜下部分和固有層分離，肌層變薄甚至斷裂，腸壁絨毛部分脫落壞死，黏腺體結(jié)構(gòu)紊亂，部分腸管可見腸壁積氣。正常對照E組(圖1E1、E2)、F組(圖1F1、F2)新生鼠的腸道結(jié)構(gòu)完整，組織結(jié)構(gòu)清晰正常。上皮完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則，絨毛高聳整齊，黏膜層、黏膜下層、固有層無充血水腫。死亡大鼠尸檢見腹脹明顯、部分有明顯腹水，腸道擴張，迂曲，顏色呈黃綠色或暗紫色，部分為黑色，腸壁積氣，符合NEC病理改變。

表1 大鼠體質(zhì)量比較 g

2.4 腸道組織病理評分

2 h大鼠組腸道病理積分組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.41，P=0.000)，48 h大鼠組組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.89，P=0.000)。詳見表2。

2.5 NEC的發(fā)生率

A、B、C、D、F、F組存活大鼠NEC發(fā)生率分別為100%(6/6)、85.71%(6/7)、100%(5/5)、100%(7/7)、0(0/8)和 0(0/8)。A、B、C、D 組NEC發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

自從1974年Barlow等[8]利用配方奶人工喂養(yǎng)、缺氧成功建立新生大鼠NEC模型后，此后大部分學(xué)者以此為基礎(chǔ)運用人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激來建立模型[9-12]。國內(nèi)亦有通過腹腔注射LPS建立NEC模型，所致模型全身炎癥重而腸道反應(yīng)輕[13]。李美雪等[14]應(yīng)用人工喂養(yǎng)和LPS灌胃成功建立NEC大鼠模型，該方法需要30 mg/kg以上的LPS方可誘導(dǎo)出典型病理改變的NEC模型，并可誘發(fā)肝、肺等臟器嚴重充血壞死。本實驗結(jié)合NEC的病因和機制[15]，參考不同胎齡NEC發(fā)病情況，選擇出生2 h以及48 h(2日齡)SD大鼠為研究對象，以人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激為基礎(chǔ)條件,選擇加或不加LPS(10 mg/kg)灌胃，均誘導(dǎo)出符合NEC臨床表現(xiàn)和組織學(xué)特征的大鼠模型。

圖1 大鼠回盲部腸道病理學(xué)觀察

表2 大鼠腸道病理積分比較

出生2 h內(nèi)造模NEC大鼠臨床癥狀重于2日齡NEC大鼠，體質(zhì)量增長率低于2日齡NEC大鼠，死亡率高于2日齡NEC，大鼠病理學(xué)改變重于2日齡NEC大鼠。與臨床上孕周越小的早產(chǎn)兒NEC發(fā)病率越高、病情越重類似。這可能與早產(chǎn)時腸道Toll樣受體4(TLR4)表達量較成熟腸道明顯升高[16], 新生大鼠腸組織TLR4表達量隨時間逐漸降低[17]，且負調(diào)控不足，對腸道細菌表現(xiàn)為過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸道發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)，腸組織壞死，導(dǎo)致NEC的發(fā)生。

LPS是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要成分，也是穿過腸道黏膜屏障的主要炎癥分子之一[6,18]。本實驗中同日齡加10 mg/kg LPS灌胃的臨床癥狀和病理學(xué)改變(病理積分)重于僅缺氧和冷暴露的大鼠。這可能與LPS能夠啟動炎癥反應(yīng)，結(jié)合CD14/TLR4/MD2受體復(fù)合物，促進炎癥細胞分泌多種細胞因子，引起強烈的炎癥反應(yīng)，并可激活補體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等有關(guān)。

新生大鼠NEC模型可用于NEC生物標(biāo)志物研究和發(fā)病機制研究，具有價格適宜，可成批量試驗等優(yōu)勢，但也要考慮人類和大鼠的差異，對應(yīng)激的恢復(fù)存在差異，當(dāng)使用大鼠誘導(dǎo)NEC時，大鼠對細菌污染和內(nèi)毒素具有更好的耐受性。本實驗中具備早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、部分母乳接觸、缺氧、冷刺激以及LPS灌胃等多種高危因素，與新生兒NEC發(fā)病機制的最新研究相似[15]，剛出生的大鼠臨床癥狀及病理情況重于生后2 d大鼠，同日齡大鼠中加LPS灌胃的臨床癥狀和病理學(xué)改變重于未加LPS灌胃的大鼠，但都成功誘導(dǎo)出NEC模型，因此可以根據(jù)研究內(nèi)容和目的進行重新組合使用，可靠性和靈活性兼?zhèn)洹?/p>