何 文，李非非，馬業(yè)菲，高 燕，褚然然

(齊魯理工學院，山東 濟南 250200)

維生素B12(VB12)又叫鈷胺素，是人體中必不可少的維生素之一。VB12主要的功能如下[1]：一是參與合成蛋氨酸、胸腺嘧啶以及蛋白質；二是轉移和貯存葉酸；三是有利于紅細胞的產生，并加速細胞的生長發(fā)育；四是促進人體中脂肪、蛋白質等物質的新陳代謝；五是參加大腦神經組織的形成，保證大腦神經組織的健全等。雖然VB12對于維持人體生理活動十分重要，但是所需要的量并不多，在日常的飲食中就可以得到補充，如肉類、動物內臟、雞蛋、牛奶等，但補充維生素的過程中要注意其補充量。食用過量可能會引發(fā)出現哮喘、蕁麻疹、濕疹等過敏反應，嚴重時甚至會導致過敏性休克，在補充VB12時注意其用量。

目前測定VB12的方法主要有分光光度法[2]、微生物法[3]和酶聯(lián)免疫法[4]、色譜-質譜聯(lián)用法[5]。分光光度法比較傳統(tǒng)，檢出限比較高；微生物法方法的靈敏度比較好，但是由于檢測周期較長，對人員的技術要求也比較高，不能夠被廣泛應用。液相色譜-質譜串聯(lián)法快速準確，但是對于設備的要求比較高，并且設備價格也比較貴，酶聯(lián)免疫法操作簡便，靈敏度準確度高，但是重復性不好以及國內市場還不夠成熟，因此，建立一種較為靈敏度較高，選擇性好，操作自動化，應用范圍廣，無需昂貴儀器的VB12的檢測方法具有重要意義。本研究主要針對奶粉樣品，采用加熱溶解、超聲提取以及高速離心等比較簡單的樣品預處理手段，結合液相色譜法測定奶粉中VB12的含量并探究其影響因素。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

VB12標準品(固)，甲醇(液，HPLC)，蒸餾水(液)，奶粉(固)，娃哈哈礦泉水(液)。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計(UV-752N)、高效液相色譜儀(1220)、數控超聲波清洗器(KQ3200DB)、色譜柱(C18)、電子分析天平(FA2004)。

2 實驗方法

(1)確定液相色譜法測定VB12的最大吸收波長：取濃度為1.4000 μg/mL維生素B12標準溶液，利用紫外可見分光光度計測定吸收光譜，波長掃描范圍為250～600 nm。

(2)確定液相色譜法測定VB12的最佳流速：首先設置流動相的流速為0.1 mL/min，保留時間10 min，然后用微量進樣器吸取50 μL濃度為1.4000 μg/mL VB12標準溶液注入液相色譜儀中進行檢測。之后其他條件不變，只改變流速0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min，分別測試不同流速條件下的維生素B12色譜流出曲線。

(3)確定液相色譜法測定VB12的流動相比例：首先把流動相設置為100%的甲醇溶液，然后用微量進樣器吸取50 μL濃度為1.4000 μg/mL的VB12標準溶液注入液相色譜儀中進行檢測。其他條件不變，逐漸改變流動相A與流動相B的比例分別為：9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9，觀察比較不同流動相比例時的VB12色譜流出曲線。

(4)確定溶解奶粉的適宜溫度：分別吸取在30、40、50、60、70、80℃溫度下的溶液，注入液相色譜儀中進行測定。

(5)確定不同前處理方法對VB12含量的影響：在使用液相色譜儀進行檢測之前要用蒸餾水進行多次沖洗，然后再用微量進樣器分別吸取2.3中超聲并離心40℃、40℃無超聲和40℃無離心的溶液50 μL送入液相色譜儀中進行檢測。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗

3.1.1 波長

由圖1可知，200～600 nm波長范圍內，VB12在278、361和550 nm處有三個吸收峰。278 nm處紫外吸收強度為0.032，但是檢測波長過低會出現較多的干擾物質如維生素B1、B2、蛋白質等，在此實驗中不適合作為檢測波長。550 nm處雖然干擾物質少但是紫外吸收強度比較低，吸光度為0.015，也不適合作為液相色譜儀的檢測波長。VB12在361 nm處的雜質較少，并且峰面積最大，吸光度為0.046，因此最終選擇361 nm作為VB12的最大吸收波長。

圖1 VB12標準品的吸收光譜

3.1.2 流速

圖2 不同流速時VB12的峰面積

圖3 不同流速時VB12的色譜流出曲線

通過速率理論得知，流動相的流量是一個調整分離度和出峰時間的重要參數。當流動相的流量較小時，分子擴散項成為色譜峰擴展的主要因素；而當流動相的流量增加時，傳質阻力項成為控制因素。由圖2可以看出，由于流速的逐漸加快，VB12標準品的色譜峰面積逐漸減小，但是色譜條件的選擇不能只依據峰面積的大小，也要考慮分離度的好壞，雖然在流速為0.1 mL/min和0.2 mL/min時的峰面積較大，但是他們二者的分離度都不好，峰形也不對稱，不能作為最佳流速。經過反復摸索和比較發(fā)現當流速為0.4 mL/min時，VB12出峰快，峰面積適宜，峰形尖而窄并且對稱，和其他的峰能夠完全分離，分離度好，專屬性也好。而其他不同流速在361 nm下的色譜峰與其他峰不能完全分離，有的甚至還出現拖峰現象。因此確定液相色譜法測定VB12的最佳流速為0.4 mL/min。

3.1.3 流動相比例

圖4 不同流動相比例時VB12的峰面積

圖5 不同流動相比例時VB12的色譜流出曲線

由圖4可知，水的比例增大，VB12峰面積變大，原因為VB12是水溶性的物質，在水中的溶解度增大，峰面積也隨之增大。當流動相甲醇與流動相水的比例為3∶7時，峰面積最大，而在圖5中此比例下的出峰時間不合適，30%甲醇和70水%不能夠作為流動相。當比例為8∶2時有雜質峰出現；9∶1時有拖峰現象；因此這二種流動相比例也不能作為最佳流動相。而是選擇100%的甲醇作為流動相，這時的色譜峰尖而窄，沒有拖峰現象，分離度也是相較于其他條件下最好的，因此在液相色譜法中最適宜的流動相為100%甲醇。

3.1.4 溫度

由圖6可知VB12的峰面積并不是隨著溫度的升高而增大的，溫度越高峰面積反而越小。雖然溫度升高有利于奶粉在水中的溶解，但是對于奶粉中的VB12來說，溫度過高會使VB12分解，所以一味地追求升高溫度的措施是不可取得。結合圖6和圖7可得，溫度過低會有雜質峰出現，并且VB12的色譜峰與雜質峰之間分離度不好，有拖峰現象，影響了對VB12的色譜峰觀察。所以經過實驗探究發(fā)現溶解VB12最適宜的溫度為40℃，這個溫度下的VB12最穩(wěn)定，峰面積與峰形也是相對較好的。因此本次實驗最佳溫度為40℃。

圖6 不同溫度時VB12的峰面積

圖7 不同溫度時VB12的色譜流出曲線

3.1.5 樣品不同前處理

圖8 不同前處理方法時VB12的峰面積

因為奶粉基質比較復雜，并且奶粉中VB12的含量甚微，其檢測過程中需要添加稀鹽酸、乙酸鈉緩沖液等蛋白質沉淀劑或者是乙醇溶液[6]，這樣有利于VB12的提取分離檢測，但是這種方法往往會造成回收率較低以及有準確度不高等缺點，本實驗采取加水溶解，經過恒溫水浴鍋加熱、超聲清洗器的超聲提取、離心機的高速離心以及濾膜的過濾等前處理[7]操作實現高效、回收率較高、檢出限較低的含量檢測的目的和探究VB12影響因素的目的。

由圖8可知，經過超聲提取和高速離心前處理的奶粉中的VB12的峰面積最大，因為超聲提取可以把奶粉中VB12釋放出來，使VB12 與水充分混合，有利于接下來的離心操作；高速離心可以使奶粉中的雜質沉淀下來，除掉雜質，有利于過0.22 μm濾膜后進入液相色譜儀進行檢測。沒有經過超聲提取的奶粉樣品溶液中的VB12的峰面積小，峰形差，與其他峰形的分離不是特別明顯。沒有經過離心操作的樣品溶液中含有大量雜質，在經過濾膜時不容易過濾，濾液中的VB12的含量非常少以至于峰面積很小。因此奶粉樣品的前處理必須經過超聲提取和高速離心這樣才可以更好的探究奶粉中VB12的影響因素。

圖9 不同前處理方法時VB12的色譜流出曲線圖

3.2 VB12標準曲線的繪制

圖10 VB12的標準曲線

由圖10可知，VB12的線性回歸方程為y=1.589x+9.006，線性相關系數R2=0.999。說明在0～0.0112 μg/mL濃度范圍內，VB12的峰面積與濃度具有較好的線性關系。

3.3 樣品溶液的測定

稱取1 g奶粉超聲離心，在波長361 nm，流速0.4 mL/min，流動相100%甲醇，溫度40℃最佳條件下檢測。由外標法計算奶粉中維生素B12含量為3.63 μg/mL，標準偏差s為0.053%。

4 結論

本文利用液相色譜法探究奶粉中維生素B12的影響因素以及維生素B12的含量，該方法對于奶粉樣品的操作便捷而實用。結果表明紫外檢測器波長為361 nm，流速是0.4 mL/min，流動相選擇100%甲醇，溫度是40℃，樣品的預處理包括超聲提取和高速離心條件下的回收率好誤差小。結果也顯示高效液相色譜法的準確度和靈敏度好，具有較高的可操作性，此方法經濟快速操作便捷，對于實際操作也沒有過多的硬性要求，因此高效液相色譜法可以作為研究奶粉中維生素B12影響因素的檢測方法，該方法也為從事食品中有關維生素B12安全檢測的相關人員提供了有價值的參考信息，在保障食品健康與安全方面有著重要意義。