秦紹釗 劉文霞 李御企 王洪

摘要：本研究采用形態(tài)學鑒定及多基因分子鑒定的方法，對貴州省油茶葉枯病病原進行分離、純化和鑒定。根據形態(tài)特征，結合ITS1-TUB2基因所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹綜合鑒定，結果表明本研究分離致病菌為擬盤多毛孢屬的小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）。分離菌株KLXY-7-3與 Genbank 中同源性較高的菌株序列比對分析，分別與小孢擬盤多毛孢菌MF375901.1、MK409844.1菌株聚為一個獨立的進化分支，且置信度為99%。本研究系統(tǒng)調查采集貴州油茶主要種植區(qū)的典型病樣，可為該病原菌發(fā)生規(guī)律及防治時期的研究提供理論依據。

關鍵詞：油茶葉枯病;小孢擬盤多毛孢菌;形態(tài)學;多基因鑒定

中圖分類號：S794.4

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191215005

油茶（Camellia oleifera）既是中國特有的木本油料作物，也是具有綠化功能的常綠小喬木，對于貴州省生態(tài)環(huán)境、社會效益和經濟效益都具有重大意義。近幾年，隨著貴州省油茶優(yōu)良新品種的引進和推廣，油茶葉枯病的發(fā)生面積也呈上升趨勢。葉枯病每年6—9月份為高發(fā)期，大部分感病葉片干枯面積達整片葉1/2以上。國內報道的擬盤多毛屬真菌侵染油茶的菌種主要茶擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）能引起油茶葉枯病[1，2]，小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）引起油茶葉枯病[3，4]，熊朝偉等人僅對玉屏地區(qū)的油茶葉枯病有所報道[5]，但尚未對貴州油茶主要產區(qū)的葉枯病進行全面性調查研究。

本研究基于貴州省主要栽培園區(qū)調查的基礎上，采集與上述報道中描述病征一致的病樣，采用形態(tài)特征和ITS1-TUB2多基因相結合的鑒定方法。病原菌研究結果表明，引起貴州油茶葉枯病病原為小孢擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora），旨在為全省油茶葉枯病的預防和病原鑒定提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

2015—2018 年采集油茶葉枯病葉片標本于凱里市、黎平縣、錦屏縣及黃平縣;玉屏縣、石阡縣、思南縣及松桃縣，分別集中于6—7月，10—11月采集病樣，分離病健交界組織，PDA 培養(yǎng)3～5d后，冰箱內4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

典型病斑呈不規(guī)則狀，紅褐色至灰褐色，病斑連片成大枯斑;病葉中病健交界處產生黑色顆粒（如圖1）。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離純化

常規(guī)組織分離法。先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無菌水漂洗干凈，PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的形態(tài)鑒定

取5mm菌餅，在PDA平板26～28℃黑暗16h培養(yǎng)，2～5d 連續(xù)觀察菌落的形態(tài)、顏色。取10μL 分生孢子懸浮液在光學顯微鏡下觀察記錄其大小及形態(tài)特征。

1.2.3分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

取50 mg 菌絲經液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259。擴增引物如下：Bt2a5GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3，Bt2b5ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3; ITS15TCCGTA GGTGAACCTGCGG3，ITS45TCCTCCGCTTATTGATATGC3。

將測序rDNA-TS1和rDNA-TUB2序列與 GenBank 中相關序列分別用ClustalX1.83軟件進行比對分析。選出與各分離菌株相似度較高的相應序列，采用 MEGA7.0.14 軟件中的鄰接法（NJ）做聚類分析，把所有的堿基狀態(tài)處理為無序，并給以相同的權重。自舉檢驗重復1000次以獲得各分支的支持率，構建鄰近法（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結果與分析

2.1病原菌菌落與形態(tài)特征

菌落為雪白色，菌絲貼近培養(yǎng)基，菌絲濃密，表面覆蓋著粉紅色茸毛狀，由中央向邊緣逐漸加厚呈明顯輪紋狀（圖2A）;培養(yǎng)5～7d 時菌落直徑7.9～9.0cm，菌落背面可見菌落因分泌色素而呈橙黃色;22℃培養(yǎng)5d后，菌落里面和菌絲表面可見散布的黑色小點即分生孢子盤（圖2B）。

分生孢子為梭形，由5個細胞組成，兩端有附屬絲，中間細胞顏色較深，一端為1根，另一端為2～3根（如圖3）;分生孢子大小為 （17.9～21.9） μm×（6.0～7.2） μm，具頂端附屬絲2～3根，多數3根為主，長14.0～16.8 μm;基部無色胞錐形，狹長，具中生式柄1根，長3.0～5.2 μm。

根據病原菌的菌落及分生孢子的特征，初步鑒定為擬盤多毛孢屬小孢擬盤多毛孢菌

（Pestalotiopsis microspora （SPeg.） G. C.Zhao et Li.comb.nov）[6]。

2.2分子鑒定

本研究以3個分離菌DNA 為模板，對其核糖體轉錄間隔區(qū)（ITS）和微管蛋白（TUB2）基因進行擴增并測序。NCBIBlastn比對后確定3個菌株同屬小孢擬盤多毛孢菌，與形態(tài)學鑒定的結果一致。代表菌株KLXY-7-3的TUB2和ITS基因序列與其它同屬菌株序列經鄰接法（NJ）共同構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，KLXY-7-3菌分別與小孢擬盤多毛孢菌（MK409844.1，MF375901.1）以99%的支持率聚為一個獨立的進化分支，并且其它真菌均以高支持率同類相聚。因此，根據分離所得鑒定結果將KLXY-7-3菌株鑒定為小孢擬盤多毛孢菌（P. microspora）。

3結論與討論

本文通過擴增擬盤多毛孢菌的ITS-TUB2基因序列，將所得序列與 GenBank中已有序列做比對，聚類分析結果顯示，擬盤多毛孢菌形成2個大的聚類群，同時該菌株形態(tài)特征與趙光材[6]等人描述的P.microspora基本一致。因此，從形態(tài)學和分子方面證明該病原菌是小孢擬盤多毛孢菌（P.microspora）。

參考文獻

[1] 盧東升，黃新華，代兵.信陽市油茶病害及其病原鑒定[J].東北林業(yè)大學學報，2012，40（5）：83-85，111.

[2]?廖旺姣，鄒東霞，吳耀軍，等.廣西油茶苗期葉枯病病原菌鑒定[J].西南農業(yè)學報，2015，28（6）：2537-2540.

[3]?李河，周國英.油茶葉枯病原的形態(tài)及ITS序列分析鑒定[J].福建林學院學報，2008，28（1）：88-91.

[4]?牛曉慶，陳良秋，付登強，等.油茶葉枯病菌的鑒定及生物學特性研究[J].熱帶作物學報，2013，34（2）：352-357.

[5]?熊朝偉，阮成江，吳波，等.玉屏油茶葉枯病病原菌分子鑒定及防治藥劑篩選[J].分子植物育種，2019，17（6）：1944-1950.

[6]?趙光材，李楠.擬盤多毛孢屬在云南的34個種[J].東北林業(yè)大學學報，1995，23（4）：21-26.

作者簡介：

秦紹釗（1981-），男，博士，副教授。研究方向：植物病害病原鑒定及綜合防控。