吳曉龍，謝艷，劉曉紅，寧桃麗，殷娜

河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)，河南 洛陽 471002

當今社會，兒童青少年生長發(fā)育的一般規(guī)律及其影響因素已是生命科學(xué)領(lǐng)域不斷深化的傳統(tǒng)研究課題。在關(guān)于生長發(fā)育的研究中，身高是重要的形態(tài)指標之一。心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[1]，身高能夠影響個體自身的人格、行為以及心理健康等。生長激素是促進骨骼生長的決定性因素，而生長激素的分泌主要在慢波睡眠期間[2]，有報道慢波睡眠的啟動和延長與5-HT有關(guān)[3]。筆者的前期實驗顯示酸棗仁提取物可以促進5-HT1AR的高表達，而柴胡提取物導(dǎo)致了5-HT分泌增多，兩種藥物均導(dǎo)致生長激素分泌增多并最終導(dǎo)致小鼠身長的增長[4,5]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上進一步對酸棗仁提取物配柴胡提取物組方促身體增長的作用及機制進行研究。

1 動物、材料及儀器

1.1 實驗動物昆明種小鼠30只，SPF級，雌性，體重15～17g，動物許可證號SCXK(豫)2015-0001 。SD大鼠30只，SPF級，雌性，體重120～150g，動物許可證號SCXK(豫)2015-0001，來自同一時期每胎6只10胎的小鼠60只，體重26～28g，動物許可證號SCXK(豫)2015-0001，均由河南省實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度(20～24)℃，濕度50%～70%，12h明暗交替，光照7:00～19:00，噪音＜50dB。

1.2 藥物與試劑酸棗仁提取物，由陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司提供(含皂甙3%～5%，市場名稱為酸棗仁皂甙，實為提取物，天然酸棗仁中含皂甙0.1%～0.14%)，使用時小鼠按照0.32mg/g體重灌胃，大鼠按照0.22mg/g體重灌胃。柴胡提取物，由西安四季生物技術(shù)有限公司提供，其中柴胡皂甙含量為5%(市場稱為柴胡皂甙，天然柴胡中柴胡皂甙含量為0.006‰～0.007‰)，使用時小鼠按照0.94mg/g體重灌胃，大鼠按照0.66 mg/g體重灌胃。酸棗仁皂甙A，(純度＞98%，購于中國食品藥品檢定研究院，批號A0274)，小鼠按照0.013mg/g體重灌胃，大鼠按照0.009mg/g體重灌胃。5-H T1A受體選擇性抑制劑P-MPPF，購于北京盛科博源生物科技有限公司；5-H T合成抑制劑LX1606，購自Selleck(批號：s2173)。小鼠5-HT1AR ELISA試劑盒(上海紀寧實業(yè)有限公司，批號201510)；Tris Base(Amresco Lot:D0194)；TritonX-100(北京化學(xué)試劑公司，批號：050205)；3H-8-OH-DPAT0.25mci(放射性比活度135ci.mmol-1)(New England Nuclear公司)；2,5二苯基噁唑(PPO)(sigma公司，Lot:D4630)，1,4-雙(5-苯基-2-噁唑基)苯(POPOP)(sigma公司，Lot:P3754)；考馬斯亮藍G-250(Solarbio公司，Lot:0120310)。

1.3 儀器酶標儀(Labsystems Multiskan MS，芬蘭，352型)；離心機(北京雷博爾離心機有限公司，LDZ5-2型)；RM-6000八導(dǎo)生理記錄儀(日本光電)；AB-621G生物電放大器(日本光電)；FZG-81直流前置放大器(上海嘉龍儀器廠)；腦立體定位儀(西北光學(xué)儀器廠)；FJ2107-P液體閃爍計數(shù)儀(西安262廠)。

2 方法

2.1 藥物對小鼠發(fā)育期體長的影響來自于同一時期10胎的小鼠，每胎3只，隨機分在3組，分別為空白組、酸柴提取物及陽性對照組，每組10只，3組小鼠原始體長無統(tǒng)計學(xué)差。酸柴提取物組灌胃酸棗仁加柴胡提取物混懸液，陽性對照組灌胃酸棗仁皂甙A水溶液，空白對照組灌胃純凈水。各組于灌胃后第20天分別麻醉動物，用直尺測定小鼠體長，從頭部最頂端到小鼠臀尾交接處即為小鼠體長，精確到1mm。

2.2 小鼠血中生長激素的含量測定各組小鼠灌胃20d測定體長后麻醉狀態(tài)下取血并處死，于室溫下待血液自然凝固20min，以離心半徑3000 r·min-1離心20min，收集上清液，采用ELISA試劑盒測定GH水平。

2.3 放射性配體受體結(jié)合法監(jiān)測5-HT1A受體配體的結(jié)合活性[6]同一時期出生的來自10胎的每胎6只小鼠，隨機分為6組，分別為空白對照組，藍墨水組，酸柴提取物組，陽性對照組，5-HT抑制劑LX1606組和5-HT1AR抑制劑P-MPPF組，每組10只。酸柴提取物組灌胃酸柴提取物混懸液，陽性對照組灌胃酸棗仁皂甙A水溶液，空白對照組和藍墨水組灌胃純凈水，5-HT抑制劑組除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后，側(cè)腦室注射加了藍墨水的LX16063mg/kg體重，5-HT1AR抑制劑組除了灌胃酸柴提取物外，最后一次灌胃后側(cè)腦室注射加了藍墨水的P-MPPF8μg/只。除了空白組最后一次灌胃后側(cè)腦室注射生理鹽水，其余各組側(cè)腦室注射等量藍墨水。30分鐘后斷頭處死小鼠，迅速剝離腦組織，取藍墨水一側(cè)(各組藍墨水的加入是為了解剖后確定藥物是否注入腦室)，加入PBS緩沖液，在冰上勻漿。低溫12000r·min-1離心30min，棄上清，離心3次，沉淀加入3mL Tris-HCL緩沖液，混合后放于37℃水浴鍋中孵育10min后，4℃12000r·min-1離心30min，棄上清，將沉淀用1.8mL的Tris-HCL反應(yīng)液勻漿混勻后加樣。孵育30min，0℃冰冷的Tris檸檬酸緩沖液負壓抽濾，將濾膜置于閃爍杯中，加入甲苯-TritonX-100閃爍液5m L，放置過夜，于閃爍計數(shù)儀上測定發(fā)生性(cpm值)。采用考馬斯亮藍法測定突觸膜中的蛋白的濃度，計算3H-Muscimol的結(jié)合量(以每毫克蛋白質(zhì)結(jié)合的3H-Muscimol的克分子數(shù)表示)。特異性結(jié)合量=[(樣品總結(jié)和-非特異性結(jié)合)。

2.4 藥物對大鼠慢波睡眠的影響由于小鼠體積太小，不方便在腦部安裝電極，所以用大鼠做此實驗。30只大鼠隨機分為5組(空白對照組、酸柴提取物組、陽性對照組、5-HT抑制劑組合、5-HT1AR抑制劑組)，每組6只，以3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉，剪去顱頂?shù)拿?，沿顱頂矢狀線切開皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨并打孔，分別在枕葉和顳葉放置電極記錄腦電圖(electroencephalogram,EEG)；分離頸部肌肉放置電極記錄肌電圖(electromyography,EMG)；打開額竇，放置電極記錄眼電圖(electrooculogram,EOG)。將各電極導(dǎo)線和微型插座相連接，用自凝牙托水拌牙托粉固定在顱骨上。術(shù)后給青霉素肌注抗感染?；謴?fù)一周后，記錄大鼠的EEG、EMG和EOG，連續(xù)記錄6h(10:00—16:00)。分析時，以每15秒為一段，采用WXL睡眠自動分析系統(tǒng)，根據(jù)它們的變化綜合判斷慢波睡眠時長，慢波睡眠時期的特征為：腦電波頻率變慢，α波減少，“梭形”波消失，出現(xiàn)θ波，最后出現(xiàn)高振幅的δ波；肌張力降低，四肢無明顯運動或抽動；呼吸循環(huán)和交感神經(jīng)的活動水平降低，但仍穩(wěn)定，表現(xiàn)為瞳孔縮小、心率與呼吸頻率減慢、血壓降低、體溫下降等。計算6h內(nèi)覺醒期(W期)、慢波睡眠期(SWS期)和異相睡眠期(PS期)及總睡眠期(TS期)的時長，連續(xù)記錄3d。每一動物取均值。統(tǒng)計5組動物慢波睡眠時長無差異。然后開始灌胃藥物，每日1次，于第3天最后一次灌胃后，5-HT抑制劑組側(cè)腦室注射LX1606，5-HT1AR抑制劑組側(cè)腦室注射P-MPPF。末次灌胃30min后，同樣記錄EEG、EMG和EOG，分析用藥后5組大鼠睡眠情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以()表示，數(shù)據(jù)采取完全隨機設(shè)計資料的方差分析，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 藥物對小鼠發(fā)育期體長的影響統(tǒng)計結(jié)果顯示，灌胃20d后酸柴提取物組動物體長均較空白組長，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)結(jié)果見表1。

3.2 藥物對小鼠血清生長激素含量的影響酸柴提取物可以促進大鼠體內(nèi)GH的分泌，與空白組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而與陽性組作用相當，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表2。

3.3 小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響酸柴提取物對小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性與空白對照組比有顯著性差異(P＜0.01)，而與陽性對照組作用相當，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，藍墨水組與空白組結(jié)果相當，證明藍墨水對實驗結(jié)果無影響，結(jié)果見圖1，表3。

3.4 藥物對大鼠慢波睡眠的影響酸柴提取物可以促進大鼠慢波睡眠延長，與空白對照組比較P＜0.01，但并不引起異相睡眠的改變，藥物組與酸棗仁皂甙A作用相當?？偹邥r長方面酸柴提取物組和陽性對照組均較空白組延長，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表4。

表1 酸柴提取物對小鼠體長的影響(±s)

表1 酸柴提取物對小鼠體長的影響(±s)

注：與空白對照組比較,1)P＜0.05；2)P＜0.01

表2 酸柴提取物對小鼠血清生長激素含量的影響(±s)

表2 酸柴提取物對小鼠血清生長激素含量的影響(±s)

注：與空白對照組比較,1) P＜0.05；2)P＜0.01

圖1 加有藍墨水的藥物側(cè)腦室注射效果對比

表3 酸柴提取物對小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響(±s)

表3 酸柴提取物對小鼠腦組織5-HT1A受體配體結(jié)合活性的影響(±s)

注：3)與酸柴組比較P＜0.01

表4 酸柴提取物對大鼠慢波睡眠的影響(±s)

表4 酸柴提取物對大鼠慢波睡眠的影響(±s)

注：3)與酸柴組比較P＜0.01

4 討論

目前批準上市的藥物中沒有適應(yīng)證是具有促進慢波睡眠的藥物，筆者前期實驗與報道都提示酸棗仁皂甙A促進慢波睡眠作用較好，所以本實驗選用酸棗仁皂甙A為陽性對照。

兒童生長發(fā)育所必需的的生長激素主要在睡眠狀態(tài)下才能高水平的分泌。尤其是慢波睡眠階段生長激素的分泌量占每日生長激素的大部分[7]。我們的實驗結(jié)果顯示，給予動物促進慢波睡眠的藥物確實可以引起動物體長的增長，且血中生長激素的含量均有所提高。

5-HT是作用于睡眠-覺醒周期的重要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。Hoeller AA等[8]報導(dǎo)慢波睡眠的啟動和5-羥色胺有關(guān)。姜巖巖等[9]發(fā)現(xiàn)，孤束核注射5-HT的大鼠覺醒期縮短，異相睡眠及慢波睡眠延長，而且5-HT1A受體激動劑可以增加SWS，所以提高腦內(nèi)5-HT或5-HT1A受體都可以促進慢波睡眠的增多。我們前期的研究顯示，可以增加大鼠腦內(nèi)5-HT1A受體的表達，同時對慢波睡眠時長有顯著延長，柴胡提取物可以增加腦內(nèi)5-HT的含量，也可以增加小鼠慢波睡眠時長和生長激素的分泌，最終也導(dǎo)致小鼠身高的增高。本實驗中我們在動物最后一次灌胃后側(cè)腦室注射特異性5-HT抑制劑和5-HT1A受體抑制劑，發(fā)現(xiàn)給予抑制劑組的動物5-HT1A結(jié)合活性降低且慢波睡眠時間縮短，因此推測酸棗仁柴胡提取物是通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)5-HT1A受體與5-HT增多，從而使5-HT受體配體結(jié)合活性增強發(fā)揮作用，這可能也是兩種藥物配伍促進生長激素分泌增多及最終體長增長的原因所在。

目前，關(guān)于中藥促進睡眠的作用及相關(guān)機制研究的文獻不少，而將藥物促進睡眠與身高增高相結(jié)合的實驗研究不多，我們的研究將會對人體增高的研究提供新的思路。酸棗仁為衛(wèi)生部首批公布的藥食同源類品種，具有安全、有效，并有著悠久的應(yīng)用基礎(chǔ)經(jīng)驗，其開發(fā)利用價值前景極為廣闊。通過我們的研究將會為今后發(fā)現(xiàn)一些基本無毒副作用、經(jīng)濟實惠的促進發(fā)育期青少年身高增高的新方法提供前期理論和實驗基礎(chǔ)。