王 杰，盧瑩瑩，錢景榮，呂博文，李文輝

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱 150081)

艱難梭菌是一種革蘭陽(yáng)性、厭氧、產(chǎn)毒的芽孢桿菌，它反映了該物種在分類學(xué)上與梭狀芽孢桿菌屬其他成員之間的差異[1-2]。艱難梭菌的孢子通過(guò)糞-口途徑傳播，病原體廣泛存在于環(huán)境中。大約5%的成年人和15%～70%的嬰兒存在艱難梭菌定植，在住院患者或療養(yǎng)院居民的定植患病率高出數(shù)倍[3]。1935年研究者首次從健康新生兒的糞便中將艱難梭菌分離出來(lái)，直到20世紀(jì)70年代，它仍被認(rèn)為是一種罕見的微生物，但存在于正常的腸道微生物群中?？咕幬锸褂煤?艱難梭菌在腸道疾病中有更高的發(fā)病率[4-5]。1974年有研究發(fā)現(xiàn)，接受克林霉素治療的患者中有21%出現(xiàn)腹瀉，經(jīng)進(jìn)一步內(nèi)窺鏡檢查，50%的病例可見假膜[4]。在20世紀(jì)末，艱難梭菌感染(CDI)的發(fā)生率明顯增加[6]。目前，CDI已成為嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)病原菌感染之一。

CDI的危險(xiǎn)因素主要包括近一段時(shí)間使用抗菌藥物、高齡、應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、長(zhǎng)時(shí)間住院、基礎(chǔ)疾病及免疫功能受損[7]。CDI是大型醫(yī)院爆發(fā)疫情的一個(gè)常見原因，治療費(fèi)用昂貴，造成醫(yī)療系統(tǒng)財(cái)政負(fù)擔(dān)沉重[8-9]。國(guó)內(nèi)對(duì)艱難梭菌引起相關(guān)疾病的報(bào)道不多，檢出的陽(yáng)性率存在差異。盡早識(shí)別與檢測(cè)艱難梭菌，了解其危險(xiǎn)因素，有針對(duì)性地防治，對(duì)減輕臨床診療和疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。因此，為了解哈爾濱地區(qū)CDI情況，對(duì)臨床資料進(jìn)行回顧性分析，對(duì)預(yù)防和控制CDI提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2018年1-12月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院腹瀉患者的糞便標(biāo)本共67份，入組患者住院期間均應(yīng)用抗菌藥物治療，抗菌藥物使用時(shí)間最短1 d，最長(zhǎng)25 d，且住院期間發(fā)生腹瀉，即24 h內(nèi)有3次或3次以上未成形大便。將糞便標(biāo)本放置在無(wú)菌容器內(nèi)，-80 ℃條件下儲(chǔ)存待檢。

1.2儀器與試劑

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定試劑 環(huán)絲氨酸、頭孢西丁、果糖瓊脂選擇培養(yǎng)基、肉湯、厭氧袋；甘油、無(wú)水乙醇、蒸餾水；0.5 mL、1.5 mL eppedorf(EP)管。

1.2.2儀器設(shè)備 系統(tǒng)顯微鏡；梅里埃質(zhì)譜儀、離心機(jī)、純水器、-80 ℃、-20 ℃冰箱、CO2恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜；振蕩器、高溫滅菌鍋；超凈工作臺(tái)；凝膠成像系統(tǒng)分析儀；微量移液器，核酸電泳儀。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng) 挑取約0.5 g糞便標(biāo)本，將其置于EP管，等量添加無(wú)水乙醇，混合均勻，基于3 000 r/min展開離心處理，10 min后,棄去上清，取糞便標(biāo)本沉淀物接種到環(huán)絲氨酸、頭孢西丁、果糖瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h后挑選出表面粗糙、凸起、灰白色、邊緣不齊、有馬糞味的可疑菌落，革蘭染色，篩選后接種到血平板培養(yǎng)基，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)、48 h進(jìn)行分離純化。使用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)分離純化后的細(xì)菌鑒定。

1.3.2菌株保存 分離純化得到的菌株洗脫到含20%甘油肉湯培養(yǎng)基中，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3煮沸法提取DNA 艱難梭菌在血平板中進(jìn)行接種，在37 ℃條件下進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h后，使用無(wú)菌棉簽洗脫到含有1 mL的蒸餾水EP管中。在沸水中處理10 min，基于12 000 r/min展開離心處理，10 min后在上清液中提取細(xì)菌DNA，并儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。

1.3.4PCR檢測(cè)艱難梭菌毒素基因 檢測(cè)艱難梭菌毒素基因tcdA、tcdB,擴(kuò)增目的基因?yàn)? 265 bp及203 bp。檢測(cè)艱難梭菌二元毒素cdtA、cdtB，擴(kuò)增目的基因?yàn)?75 bp及510 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL,依次加入0.2 μL上下游引物；緩沖液10×2.5 μL；dNTPs 2 μL；DNA模板2 μL；Tap酶1.5 μL；無(wú)菌ddH2O 18.45 μL。所有擴(kuò)增產(chǎn)物展開1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為200 V、90 mA,10 min后將膠塊放置在凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.5多位點(diǎn)序列分型(MLST) 選取adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL，依次加入上下游引物各0.5 μL；緩沖液10×5 μL；dNTPs 4 μL；DNA模板3 μL；Tap酶0.25 μL；無(wú)菌ddH2O 36.75 μL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京康普森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。擴(kuò)增位點(diǎn)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubmlst.org/cdifficile)比對(duì),在每個(gè)位點(diǎn)獲得特異的等位基因數(shù)，形成對(duì)應(yīng)的等位基因譜，確定相應(yīng)的序列類型。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料中正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)；CDI危險(xiǎn)因素分析采用Logistic回歸；P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1艱難梭菌菌株分離、毒素檢測(cè)結(jié)果 67例糞便標(biāo)本通過(guò)厭氧培養(yǎng)共獲得10株艱難梭菌，艱難梭菌陽(yáng)性率14.9%。產(chǎn)毒菌株共有10株，毒素A基因和毒素B基因全部為陽(yáng)性的共8株，檢出率為80.0%，1株為二元毒素基因陽(yáng)性；10株中，2株僅有毒素B基因陽(yáng)性，檢出率為20.0%。

表1 患者基本資料分析

表2 CDI危險(xiǎn)因素分析

2.2艱難梭菌MLST分型結(jié)果 MLST分型：共有5個(gè)ST型，5株ST2型，2株ST3型，1株ST102型，1株54型，1株201型?；蚍中徒Y(jié)果顯示，本地區(qū)艱難梭菌基因型別較為分散，但是ST2型為主要的基因型別(50%)。

2.3CDI危險(xiǎn)因素 67例患者中，CDI組12例，非艱難梭菌院內(nèi)腹瀉組(CDN組)55例。兩組患者平均年齡分別為(59.1±15.05)歲和(64.67±13.8)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。分析兩組患者的危險(xiǎn)因素表明，使用氟喹諾酮類抗菌藥物是CDI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR值=3.12，P=0.036)，患者性別、基礎(chǔ)疾病、胃腸道手術(shù)、侵入性檢查、化療藥物、質(zhì)子泵抑制劑的使用等均與CDI發(fā)生無(wú)關(guān)(P>0.05)。CDN、CDI兩組患者血紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞、清蛋白、血清肌酐、尿素氮等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

3 討 論

近年來(lái)，艱難梭菌已成為引起院內(nèi)感染性腹瀉和腸炎的主要病原體。由于抗菌藥物濫用，造成腸道菌群紊亂，艱難梭菌大量增殖，同時(shí)釋放毒素，導(dǎo)致感染性疾病的出現(xiàn)，其主要的表現(xiàn)就是腸道病理性損傷[10-11]。我國(guó)CDI患病率不斷上升，2009年我國(guó)上海市一家醫(yī)院研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)住院患者CDI患病率僅為1.7/10 000住院患者。在一篇薈萃分析中顯示，我國(guó)2009—2015年CDI引起的住院患者腹瀉率是19%，高于歐美國(guó)家報(bào)道。本研究中CDI患病率是14.9%，與國(guó)外研究報(bào)道接近[12]。

CDI危險(xiǎn)因素較多，可分為宿主因素如年齡、基礎(chǔ)性疾病、長(zhǎng)期住院、免疫抑制使用等和醫(yī)源性因素如使用抗菌藥物、胃腸道手術(shù)、使用質(zhì)子泵抑制劑、腫瘤化療等[13]。高齡、長(zhǎng)時(shí)間住院和應(yīng)用抗菌藥物是CDI主要危險(xiǎn)因素[13]。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)高齡與CDI有關(guān)，但研究表明，艱難梭菌在老年人群中易受感染。相比于年齡<65歲的患者，患者年齡大于或等于65歲發(fā)生CDI的風(fēng)險(xiǎn)增加5～10倍，年齡大于或等于65歲不僅是CDI本身的重要危險(xiǎn)因素，也是包括CDI嚴(yán)重程度和病死率在內(nèi)不良臨床結(jié)局的重要危險(xiǎn)因素[8]。

住院患者艱難梭菌定植的比例因國(guó)家、患者年齡和住院時(shí)間的不同而不同[14-15]。本研究中未發(fā)現(xiàn)住院時(shí)間與CDI有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在住院的第1天，艱難梭菌的患病率在2.1%～20.0%，并且隨著住院時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，例如HUANG等[16]的一項(xiàng)研究表明，CDI患病率上升到20.0%～45.4%。PONNADA等[17]的一項(xiàng)研究表明，住院1個(gè)月后CDI患病率從2.1%增加到50.0%。在KHANNA等[18]的一項(xiàng)研究中，住院時(shí)間超過(guò)1個(gè)月CDI患病率在1%～50%。

幾乎每一種抗菌藥物都與CDI有關(guān)，包括用于治療CDI的藥物甲硝唑和萬(wàn)古霉素。與其他抗菌藥物對(duì)比，碳青霉烯類、頭孢菌素類、克林霉素及氟喹諾酮類抗菌藥物誘發(fā)CDI的可能性要更高一些[19-20]。該研究發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物通常被認(rèn)為是CDI的危險(xiǎn)因素，優(yōu)勢(shì)比(OR值)為5.651 4[20]。降低住院患者氟喹諾酮類藥物用量，4年內(nèi)CDI患病率下降了17.45%[20]。在抗菌治療期間和治療4周后，發(fā)生CDI的風(fēng)險(xiǎn)是治療前的8～10倍，在接下來(lái)的2個(gè)月會(huì)增加3倍[4]。正如BROWNE等[21]的一項(xiàng)研究，在過(guò)去30 d中，近期使用抗菌藥物的患者CDI患病率高出2.41倍，抗菌藥物使用的增加與抗菌藥物相關(guān)性腹瀉的流行具有一致性[12,21]。在本研究中僅發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物與CDI有關(guān)，因此抗菌藥物使用在本次研究中未能全面體現(xiàn)出來(lái)。

4 結(jié) 論

現(xiàn)階段，艱難梭菌醫(yī)院感染患病率不斷增加,CDI問(wèn)題獲得社會(huì)廣泛關(guān)注。本研究中發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物的使用是CDI獨(dú)立危險(xiǎn)因素，住院患者中存在部分CDI情況。研究當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)情況和危險(xiǎn)因素，對(duì)后續(xù)針對(duì)性治療提供依據(jù)。在實(shí)際工作當(dāng)中,應(yīng)合理使用抗菌藥物，控制醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)艱難梭菌傳播。