徐銀海，孫靜芳，李世寶，朱迎星，胡 闞，馬 萍

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221002)

食管癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為25%～30%[1]。據(jù)GLOBOCAN 2018統(tǒng)計世界范圍內(nèi)每年大約有新發(fā)病例572 000例，死亡病例508 100例[2]。我國食管癌每年新發(fā)病例477 900例，死亡病例375 000例[3]。早期診斷是減少食管癌病死率最有效的手段，研究顯示，早期食管癌患者手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)85%[4]，但食管癌的臨床癥狀不典型且目前沒有有效的標(biāo)志物來早期發(fā)現(xiàn)食管癌的存在，大部分患者在確診時已經(jīng)是晚期，錯過了最佳治療時期。因此，亟需一種敏感、特異的標(biāo)志物對食管癌進(jìn)行診斷和預(yù)后跟蹤。

近年來，表觀遺傳學(xué)機(jī)制備受研究者的關(guān)注，其中，DNA發(fā)生異常甲基化是腫瘤常見的表觀遺傳學(xué)改變。Septin9基因廣泛存在于人類細(xì)胞中，在細(xì)胞分裂中起關(guān)鍵作用[5]。已有研究表明，在多種惡性腫瘤中存在Septin9基因甲基化改變，如結(jié)腸癌[6-8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]等，但其在食管癌中的研究甚少涉及。因此，本研究旨在通過對外周血Septin9 基因甲基化的檢測，評估其在食管癌診斷中的價值，以期發(fā)現(xiàn)一種相對敏感、特異的標(biāo)志物對食管癌進(jìn)行輔助診斷。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1-12月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院初診的食管癌患者(實驗組)31例，其中男23例，女8例，健康人群20例(對照組)。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。其中食管癌的診斷均由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理學(xué)確診報告且資料完整。食管癌患者的血樣采集均為術(shù)前血樣，且未經(jīng)過相關(guān)的治療。

1.2儀器與試劑 ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀(美國，ABI公司)；人Septin9基因甲基化檢測試劑盒(蘇州，天隆科技)

1.3血樣采集與制備 取外周血10 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，采樣后立即處理。全血1 600 g離心10 min，轉(zhuǎn)移血漿至新的15 mL離心管，分離血漿再1 600 g離心10 min，將上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中-80 ℃保存。

1.4檢測方法 依據(jù)試劑說明書依次加入蛋白酶K溶解液、裂解液、磁珠、提取漂洗液、洗脫液等進(jìn)行血漿樣本DNA提取，依次加入轉(zhuǎn)化試劑、DNA保護(hù)液、結(jié)合液、磁珠、純化漂洗液、洗脫液對提取的血漿樣本DNA進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，依據(jù)試劑說明書加入PCR Mix、DNA聚合酶配制反應(yīng)體系，加入樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增定量等步驟。

1.5結(jié)果判讀 檢測樣本FAM通道的Ct值<50且內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果Ct值≤32判為陽性；檢測樣本FAM通道的Ct值無數(shù)值且內(nèi)標(biāo)VIC通道的Ct值≤32，結(jié)果判為陰性；若檢測過程中內(nèi)標(biāo)檢測無數(shù)值或Ct值>32，樣本DNA純度或濃度過低，則檢測結(jié)果無效，應(yīng)當(dāng)重新采樣檢測。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評價Septin9對食管癌的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 實驗組和對照組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

2.2Septin9對食管癌的診斷價值 Septin9診斷實驗組陽性率為67.7%(21/31)，對照組陽性率為0(0/20)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.03，P=0.000)。見表2。Septin9診斷食管癌的ROC曲線下面積為0.839，靈敏度為67.6%，特異度為100.0%，見圖1。

2.3Septin9與食管癌臨床病理分期的關(guān)系 Septin9的檢出率在食管癌的分化程度、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 Septin9基因甲基化在食管癌患者檢出結(jié)果(n)

注：1表示Septin9對食管癌的診斷能力；2表示參考線

圖1Septin9診斷食管癌的ROC曲線

表3 Septin9基因甲基化與食管癌臨床病理分期之間的關(guān)系

3 討 論

Septin9基因廣泛存在于人類細(xì)胞中，編碼 GTP 結(jié)合蛋白，在細(xì)胞分裂中起關(guān)鍵作用[5]。越來越多的研究表明多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及表觀遺傳學(xué)的異常改變，而DNA甲基化是其中常見的表觀遺傳學(xué)改變。自2008年LOFTON等[11]首次報道Septin9基因甲基化可以作為篩查結(jié)腸癌的指標(biāo)以來，國內(nèi)外多位學(xué)者發(fā)表了一系列的關(guān)于Septin9基因甲基化篩查結(jié)腸癌的文章[6-8,12]，劉彥魁等[8]的研究發(fā)現(xiàn)Septin9基因甲基化不僅發(fā)生在結(jié)腸癌中，在胃癌、食管癌等其他惡性腫瘤中也可檢測到，但目前關(guān)于Septin9在食管癌中的研究甚少。

本研究結(jié)果顯示Septin9基因甲基化可作為食管癌篩查的一個指標(biāo)：以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，其在篩查食管癌中的ROC曲線下面積為0.839，靈敏度和特異度分別為67.6%和100.0%，與健康對照組比，有顯著差異。劉彥魁等[8]對27例食管癌進(jìn)行Septin9基因甲基化檢測，陽性率為25.9%，低于本研究的67.6%，這可能與患者之間的差異性及檢測方法有關(guān)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對其在食管癌中的檢測效能進(jìn)行驗證。在本研究中，外周血Septin9基因甲基化與食管癌的各臨床病理特征之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示Septin9基因甲基化的檢出可能與腫瘤的臨床病理特征之間無直接的聯(lián)系。劉彥魁等[8]的研究結(jié)果顯示Septin9基因甲基化Ⅰ、Ⅱ期患者的發(fā)生比例低于低于Ⅲ、Ⅳ期患者，提示Septin9基因甲基化的發(fā)生隨著臨床分期的進(jìn)展而增加，CHURCH等[13]得到與此類似的研究結(jié)果。但本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)腫瘤的臨床病理特征影響Septin9基因甲基化狀態(tài)，可能是不同檢測試劑盒的靈敏度和特異度對檢測結(jié)果造成的不同影響，也有可能是本研究的樣本量較少，使結(jié)果相對局限，未能顯示出Septin9基因甲基化與腫瘤臨床病理特征之間的關(guān)系。除樣本量較少這一不足之外，食管癌沒有相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物做對照也是一處不足，沒有體外診斷的其他指標(biāo)來做比較，僅Septin9一個指標(biāo)來診斷食管癌，說服力欠妥。

雖然本研究存在一定的局限性，但其在食管癌患者中相對高的靈敏度和特異度提示Septin9基因甲基化可以作為食管癌的一個初篩指標(biāo)，以輔助其早期診斷，適當(dāng)?shù)貜浹a食管癌目前臨床缺乏特異腫瘤標(biāo)志物的缺陷。

綜上所述，本研究結(jié)果證明檢測外周血中Septin9基因甲基化狀態(tài)可作為輔助篩查食管癌的腫瘤標(biāo)志物，作為一種新的無創(chuàng)的食管癌的篩查方法，其無創(chuàng)、采樣方便、靈敏度和特異度較強(qiáng)的優(yōu)勢是比較適合輔助食管癌臨床篩查的。