張大煒，夏 云，趙靳鑫，陳盈竹，鄒家齊，嚴(yán) 佳，楊 蜜

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

艱難梭菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌[1]，是醫(yī)院感染性腹瀉的主要病原菌，主要引起自限性腹瀉到中度腹瀉、偽膜性腸炎。重癥患者會(huì)出現(xiàn)中毒性巨腸炎、腸穿孔、感染性休克等并發(fā)癥,甚至最終導(dǎo)致死亡[2-3]。隨著大量使用廣譜抗菌藥物、質(zhì)子泵抑制劑，艱難梭菌感染的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率和病死率越來(lái)越高，艱難梭菌感染已成為世界范圍內(nèi)一個(gè)廣受關(guān)注的新型公共衛(wèi)生問題[4]。甲硝唑、萬(wàn)古霉素、非達(dá)霉素是2018年美國(guó)感染病學(xué)會(huì)推薦治療艱難梭菌感染的主要藥物[5]，前兩者都不是特異性地針對(duì)艱難梭菌，這種非特異性的殺菌往往導(dǎo)致腸道相關(guān)菌群的改變，造成艱難梭菌致病核糖體型的選擇優(yōu)勢(shì)。臨床常出現(xiàn)常規(guī)抗菌藥物治療效果不可預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)率較高的情況，并且目前已發(fā)現(xiàn)對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素均耐藥的菌株[6]。非達(dá)霉素作為治療艱難梭菌感染的窄譜新藥，尚未有明確的臨床療效評(píng)估，且在不遠(yuǎn)的將來(lái)有再度耐藥的可能。近年來(lái)有用滅活毒素制備艱難梭菌疫苗的報(bào)道[7-9]，由于尚處于臨床試驗(yàn)階段，療效尚未可知。艱難梭菌最主要的致病因子是其產(chǎn)生的毒素。有研究報(bào)道稱，tcdB是造成產(chǎn)毒艱難梭菌毒力的主要原因[10]。CRISPR/Cas9技術(shù)由于其高效的基因編輯能力而被廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。目前CRISPR-Cas系統(tǒng)多應(yīng)用于真核細(xì)胞基因編輯領(lǐng)域，而應(yīng)用于原核生物特別是作為抗微生物藥物的研究尚不多見。有研究證明CRISPR/Cas9可以序列特異性的方式殺滅肺炎鏈球菌[11]，且細(xì)菌基因組內(nèi)的任何序列都可以作為基于CRISPR抗微生物藥物的靶標(biāo)[12]。

本文旨在建立靶向抑制tcdB基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，運(yùn)用穿膜肽將sgRNA和Cas9導(dǎo)入菌體內(nèi)，在體外特異性切割艱難梭菌主要毒力因子tcdB基因，以特異性抑制致病菌株的生長(zhǎng)。為開發(fā)一種新的治療方法，降低臨床抗菌藥物非特異性的殺菌導(dǎo)致的腸道相關(guān)菌群失調(diào)的影響，提供思路。

1 材料與方法

1.1菌株和引物 艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43255，為本實(shí)驗(yàn)室保存；根據(jù) GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 提 供 的 艱難梭菌 tcdB基因全長(zhǎng)序列(Gene ID:491407 4)以引物設(shè)計(jì)軟件premier5.0 設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因擴(kuò)增引物，序列分別為上游引物:5′-ACT GTA GTA GAA TCA GCA ATA AAT GAT ACA C-3′; 下游引物:5′-TCC TCT CTC TGA ACT TCT TGC TAA TGA AG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 299 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在線設(shè)計(jì)sgRNA序列為：ATG AAC AAG AGT TGG TAG AAA GG。由于適當(dāng)延長(zhǎng)可以增強(qiáng)穩(wěn)定性和剪切效果，利于轉(zhuǎn)化，上游延申后形成CTT ATA TGA ACA AGA GTT GGT AGA AAG G，作為靶向tcdB的sgRNA序列。用于與Cas9綴合的穿膜肽(CPP)序列為：4-馬來(lái)酰亞胺基-GGG RRR RRR RRR LLL L(m9R)，用于與sgRNA連接的CPP序列為：CGG GRR RRR RRR RLL LLC(9R)。

1.2細(xì)菌培養(yǎng) 艱難梭菌培養(yǎng)：厭氧液體培養(yǎng)基(北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司)，布魯菌血瓊脂(重慶龐通醫(yī)療器械有限公司)，37 ℃厭氧袋培養(yǎng)；其他腸道菌培養(yǎng)：LB 培養(yǎng)基(Bioflux)，哥倫比亞血平板(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，37 ℃培養(yǎng)。

1.3儀器與試劑 Cas9和sgRNA(百奧邁科生物技術(shù)有限公司)濃度均為0.2 μg/μL、反應(yīng)液(南京金斯瑞生物科技有限公司)、DL 2 000 DNA 標(biāo)志物(Takara)、細(xì)菌DNA提取試劑盒(廣州欣研生物科技有限公司)、DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、PCR 擴(kuò)增儀(重慶道益醫(yī)療器械有限公司)、GelDocTMXR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD)、氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市岸頭國(guó)瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠)、恒溫培養(yǎng)箱(Heal Force)、電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。

1.4CRISPR體外切割靶基因

1.4.1tcdB基因的擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為20 μL：ddH2O 7.2 μL，上游引物 0.4 μL,下游引物 0.4 μL，模板2 μL，Taq酶10 μL；擴(kuò)增步驟為95 ℃10 min 預(yù)變性；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min延伸。擴(kuò)增引物序列如1.1 所示，擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA產(chǎn)物純化試劑盒提純，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)目標(biāo)基因擴(kuò)增成功。

1.4.2CRISPR系統(tǒng)對(duì)tcdB的切割 (1)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，設(shè)置反應(yīng)混合物(擴(kuò)增產(chǎn)物40 nmol/L×2.5 μL，sgRNA 0.2 μg/μL×2 μL，Cas9 0.2 μg/μL×2 μL，反應(yīng)液 4 μL，用焦碳酸二乙酯處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的純水(DEPC-H2O)9.5 μL。(2)將sgRNA與反應(yīng)液預(yù)混 90 ℃孵育10 min，并緩慢冷卻至室溫使sgRNA退火。(3)在未加DNA的反應(yīng)混合物中加入和sgRNA等摩爾量的Cas9蛋白，室溫下孵育30～60 min。(4)將靶DNA添加到反應(yīng)混合物中，并立即在37 ℃下孵育1～2 h，開始切割反應(yīng)。(5)取出10 μL樣品，加入1 μL蛋白酶K，37 ℃孵育30 min，以消化與DNA結(jié)合的Cas9。(6)配置1%瓊脂糖凝膠電泳，于1孔加入2 000 bp的 DNA 標(biāo)志物，2、3、4孔加入1.4.1的擴(kuò)增產(chǎn)物，并分別于2、3孔加入sgRNA和Cas9，5孔加入1.4.2處理后的切割產(chǎn)物。220 V 30 min瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)顯像。將1.4.2處理后的切割產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序，以驗(yàn)證是否在預(yù)期位點(diǎn)切割成功。

1.5CPP-sgRNA、CPP-Cas9的制備

1.5.1CPP-Cas9的制備 (1)在pH7.4的緩沖液(PBS)中純化Cas9蛋白(1 mg)、m9R肽(50 μg)，用于綴合。(2)將m9R逐滴加入Cas9蛋白質(zhì)中進(jìn)行綴合，不斷輕拍管子以保證均勻混合。(3)使反應(yīng)在振動(dòng)器上室溫下持續(xù)2 h。(4)過量游離或未結(jié)合的m9R肽是通過在pH7.4的PBS中4 °C，24 h透析除去。透析過程中更換2～3次緩沖液(PBS)。(5)對(duì)于透析，使用相對(duì)分子質(zhì)量50×103的截留膜來(lái)確保透析袋中僅保留Cas9-m9R蛋白(168 ×103)，而游離m9R(2×103)被除去。(6)從透析膜收集Cas9-m9R蛋白，使用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)。

1.5.2CPP-sgRNA的制備 將sgRNA和9R肽以1∶3的摩爾量混合，室溫下孵育30 min，形成sgRNA：9R復(fù)合物。

1.6CRISPR對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌生長(zhǎng)的抑制作用 配置0.5麥?zhǔn)蠞舛染?，?支無(wú)菌試管編號(hào)，每管加入1 800 μL厭氧肉湯，200 μL菌液。管1作為空白對(duì)照，管2～6分別加入CPP-sgRNA、CPP-Cas9、CPP、CPP-sgRNA+CPP-Cas9、sgRNA+CPP-Cas9。6支試管震蕩混勻，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、6、12、18、24 h接種布魯菌血瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)，并測(cè)菌液A值。

1.7特異性驗(yàn)證 用同樣的方法將CRISPR系統(tǒng)(CPP-sgRNA+CPP-Cas9)分別作用于不產(chǎn)毒艱難梭菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等細(xì)菌，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié) 果

2.1tcdB基因擴(kuò)增產(chǎn)物的切割 瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序結(jié)果均顯示，加入sgRNA和Cas9后，靶基因在預(yù)期位點(diǎn)被成功切割開;單獨(dú)加入sgRNA或Cas9后，靶基因未被切割開。

注:M為標(biāo)志物、1為sgRNA、2為Cas9、3為空白對(duì)照、4為sgRNA+Cas9

圖1CRISPR系統(tǒng)切割tcdB基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2CRISPR對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用 根據(jù)測(cè)定A值及菌落計(jì)數(shù)結(jié)果繪制經(jīng)CRISPR不同成分處理產(chǎn)毒艱難梭菌的生長(zhǎng)曲線，與空白對(duì)照比較，加入CPP-sgRNA+CPP-Cas9 顯著抑制產(chǎn)毒艱難梭菌生長(zhǎng)，加入sgRNA+CPP-Cas9對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌生長(zhǎng)有輕度抑制作用。而單獨(dú)加入CPP-sgRNA、CPP-Cas9或CPP對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌生長(zhǎng)無(wú)影響。同時(shí)將CRISPR(CPP-sgRNA + CPP-Cas9)作用于不產(chǎn)毒艱難梭菌，根據(jù)測(cè)定A值及菌落計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)CRISPR只對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌有作用，對(duì)不產(chǎn)毒菌株無(wú)作用，表明本研究設(shè)計(jì)的CRISPR系統(tǒng)只對(duì)含有tcdB基因的產(chǎn)毒株有切割效果。同樣的方法用其他細(xì)菌做效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，見圖 2、3，A值及菌落計(jì)數(shù)均和空白對(duì)照無(wú)差別。

圖2 CRISPR系統(tǒng)對(duì)不同細(xì)菌生長(zhǎng)的吸光度的影響

注：縱坐標(biāo)菌落計(jì)數(shù)取Log10的對(duì)數(shù)

圖3CRISPR系統(tǒng)對(duì)不同細(xì)菌生長(zhǎng)的菌落計(jì)數(shù)的影響

3 討 論

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種新型的基因編輯技術(shù)逐步被用于對(duì)病原微生物的研究中。CITORIK等[13]運(yùn)用CRISPR技術(shù)使 blaNDM-1 和 blaSHV-18兩種耐藥基因的表達(dá)下降了100～1 000倍，這種高效的基因抑制作用可有效地阻止耐藥突變株出現(xiàn)，因此CRISPR-Cas系統(tǒng)作為全新的抗菌藥物制劑頗具開發(fā)潛力。這也使得運(yùn)用CRISPR技術(shù)靶向切割毒力因子tcdB基因，抑制致病艱難梭菌生長(zhǎng)成為可能。

本研究中，CRISPR/Cas9在體外直接切割靶基因：由圖1結(jié)果可知單獨(dú)添加sgRNA或Cas9對(duì)靶基因無(wú)切割效果；只有將sgRNA和Cas9共同作用，才能將靶基因在預(yù)期的靶點(diǎn)成功切割開來(lái)，證實(shí)了本研究設(shè)計(jì)的sgRNA在體外切割測(cè)試中取得了成功。

用CPP-sgRNA與CPP-Cas9共同作用，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)；單獨(dú)sgRNA與CPP-Cas9共同作用，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響輕微。表明單獨(dú)的sgRNA遞送能力差，CPP可以提高sgRNA的遞送效率，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。sgRNA與CPP的預(yù)混能更好地將sgRNA遞送到菌體內(nèi)，其原因可能是sgRNA和細(xì)胞膜本身都帶負(fù)電荷，不易導(dǎo)入；當(dāng)將CPP和sgRNA混合時(shí)能形成縮合的帶正電的納米顆粒，有助于將sgRNA遞送到細(xì)胞中[14]。單獨(dú)加CPP-sgRNA、CPP-Cas9或CPP的菌落計(jì)數(shù)和A值與和空白對(duì)照管相差無(wú)異，表明CRISPR作用的發(fā)揮需要sgRNA和Cas9二者共同作用。另外單獨(dú)的CPP對(duì)細(xì)菌也無(wú)作用，這與ABUSHAHBA等[15]所持觀點(diǎn)一致。

CRISPR/Cas9載體的有效遞送是實(shí)現(xiàn)高效靶基因表達(dá)抑制的關(guān)鍵，應(yīng)用CRISPR系統(tǒng)消除tcdB基因的表達(dá)的關(guān)鍵就是如何將sgRNA和Cas9有效地遞送至目標(biāo)細(xì)菌體內(nèi)。目前尚缺乏適宜的運(yùn)載工具。將表達(dá)sgRNA和Cas9的質(zhì)粒采用轉(zhuǎn)染劑或電轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)染進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞的方式轉(zhuǎn)染效率不高。獲得較高轉(zhuǎn)染效率的做法是采用噬菌粒為載體[16-17]。但因其難于純化、宿主范圍窄、要求細(xì)菌必須表達(dá)適宜的表面噬菌體受體等因素，實(shí)際轉(zhuǎn)染效率并不高[18]。而且目前還發(fā)現(xiàn)艱難梭菌細(xì)胞壁蛋白CwpV具有抵抗噬菌體的作用[19]，因此采用噬菌粒作為質(zhì)粒遞送工具對(duì)于艱難梭菌并不可行。

另一種比較有潛力的是使用CPP與重組Cas9蛋白和sgRNA結(jié)合后可以直接遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)[20]。CPP以其穿膜效率高、細(xì)胞毒性低、可以攜帶各種生物活性分子等優(yōu)點(diǎn)因而在細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面得到廣泛應(yīng)用[21-22]。目前常用的針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的穿膜肽有(KFF)3K、GRKKKRRQRRRYK、(RXR)4XB，據(jù)報(bào)道，GRKKKRRQRRRYK、(RXR)4XB的穿膜效果最好[15]。有研究采用(KFF)3K、(RXR)4XB作為CPP攜帶靶向gyrA和ftsZ基因的肽核酸成功抑制多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)[23-24]。目前使用穿膜肽遞送CRISPR的應(yīng)用鮮見報(bào)道。

本研究首次運(yùn)用穿膜肽來(lái)遞送CRISPR系統(tǒng)。本研究中使用CPP遞送sgRNA和Cas9蛋白，與將同時(shí)表達(dá)sgRNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，避免了通過質(zhì)粒介導(dǎo)遞送到細(xì)胞中導(dǎo)致的質(zhì)粒序列不可控制地整合到宿主基因組中，以及附加的免疫反應(yīng)和由細(xì)菌序列引起的潛在的安全問題。CPP介導(dǎo)的RGEN傳遞系統(tǒng)，無(wú)需質(zhì)粒和額外的轉(zhuǎn)染試劑，并且減少了脫靶效應(yīng)[14]。本研究使用以穿膜肽為載體的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)艱難梭菌tcdB毒素基因的切割，抑制了艱難梭菌的生長(zhǎng)。其原因可能與細(xì)菌缺少非同源末端連接的修復(fù)途徑，運(yùn)用CRISPR后引起的DNA雙鏈斷裂缺口容易引起細(xì)胞死亡有關(guān)[25]。經(jīng)其他細(xì)菌的特異性驗(yàn)證，本研究中設(shè)計(jì)合成的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌顯示了高度的特異性。

本研究構(gòu)建的針對(duì)艱難梭菌毒素基因tcdB的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過穿膜肽轉(zhuǎn)染的方法，明確了CRISPR-Cas9能夠高效特異切割艱難梭菌tcdB毒素基因，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于產(chǎn)毒艱難梭菌的精準(zhǔn)特異治療奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)成功構(gòu)建了利用穿膜肽遞送CRISPR/Cas9的新型遞送系統(tǒng)，為臨床治療耐藥菌感染提供了新的思路。由于該系統(tǒng)只對(duì)產(chǎn)毒艱難梭菌有作用，對(duì)不產(chǎn)毒艱難梭菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等細(xì)菌無(wú)作用，有利于保護(hù)腸道正常菌群，顯示了其良好的應(yīng)用前景。同時(shí)本研究尚存在不足之處，比如由于未做小鼠模型驗(yàn)證，本研究所建立的體系能否應(yīng)用于體內(nèi)環(huán)境及可能存在的問題和缺陷，尚有待于進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)的CRISPR系統(tǒng)可靶向切割tcdB毒素基因，抑制致病艱難梭菌生長(zhǎng)，且具有高度特異性，有利于保護(hù)腸道正常菌群，為解決臨床抗菌藥物非特異性殺菌導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的問題及耐藥菌感染的治療提供了新的思路。