吳 薇，曹子文，文江平△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院檢驗科，北京 100730;2.首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)系，北京 100069)

降鈣素原(PCT)在正常生理情況下由甲狀腺旁C細(xì)胞產(chǎn)生，是無激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，可經(jīng)特異性肽鏈內(nèi)切酶裂解生成降鈣素[1-2]。在健康成年個體中PCT水平非常低(<0.1 ng/mL)，但在細(xì)菌感染時循環(huán)系統(tǒng)中的PCT水平會快速升高[3]，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染性膿毒癥的診療[4-6]。PCT檢測方法中化學(xué)發(fā)光法靈敏度高，最低可檢出0.02 μg/L的PCT[7]，是檢測PCT的最佳方法[8]。臨床上普遍認(rèn)為成年人PCT的參考區(qū)間為PCT<0.05 ng/mL。但參考區(qū)間存在變異，所以實驗室有必要為不同年齡、性別的人群建立PCT的參考區(qū)間。兒童與成年人相比，更易發(fā)生感染性疾病。報道顯示出兒童PCT參考區(qū)間可能會高于成年人[9-11]。

本研究參考國際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ISO)15189相關(guān)準(zhǔn)則，按照實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)規(guī)定的參考個體標(biāo)準(zhǔn)[12]，采用回顧性采樣法[13]，初步探討用微粒子酶促化學(xué)發(fā)光法測定PCT，調(diào)查適用于兒童(≤14歲)及本實驗室檢測系統(tǒng)的PCT生物參考區(qū)間，旨在合理利用PCT檢測結(jié)果診斷兒童是否發(fā)生細(xì)菌感染，指導(dǎo)抗菌藥物使用，為相關(guān)疾病診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2019年2月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院進(jìn)行術(shù)前檢查的兒童，年齡為出生后3 d至14歲。就診原因僅限于眼科疾病如高度近視、白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜脫落、角膜移植、斜視、屈光不正，及耳鼻喉科疾病如腺樣體肥大、唇裂、先天性耳前瘺、先天性耳聾。入選標(biāo)準(zhǔn)：營養(yǎng)良好，無發(fā)熱、貧血、黃疸及藥物使用或慢性病史。年齡為出生后3 d至14歲。血壓、B超、胸片正常，肝功常規(guī)、腎功常規(guī)、血脂常規(guī)、離子常規(guī)、血常規(guī)，C反應(yīng)蛋白(CRP)和尿常規(guī)檢查均正常。具體指標(biāo)的數(shù)值需符合兒童專用的參考區(qū)間[14]。排除標(biāo)準(zhǔn)：參考個體排除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》中所規(guī)定的要求，排除存在貧血、上呼吸道感染、發(fā)熱、甲狀腺疾病、腫瘤、肝腎疾病、過敏反應(yīng)、結(jié)締組織病、免疫缺陷病和風(fēng)濕性疾病等內(nèi)科疾病的患者。排除嚴(yán)重失血、嚴(yán)重外傷或休克、傷口感染、應(yīng)激性反應(yīng)等外科疾病的患者。排除個體肥胖、近期服用藥物、有過外科手術(shù)、食素、有家族遺傳病史的患者。排除年齡為0～3 d的兒童、存在急慢性炎癥及近3個月來最近一次實驗室檢查結(jié)果在上述檢查項目正常參考區(qū)間外的患者。標(biāo)本剔除標(biāo)準(zhǔn)為：微生物污染的樣本；高度溶血、黃疸或乳糜樣本，水平以性能驗證為準(zhǔn)，廠家參考區(qū)間為血紅蛋白<7.6 mmol/L，膽紅素<541 μmol/L，三酰甘油<18.29 mmol/L；凍融1次的全血標(biāo)本或反復(fù)凍融2次以上的血清樣本。經(jīng)以上入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)剔除不合格者，最終入選400例出生3 d至14歲的就診患者，其中男217例、女183例。再嚴(yán)格按照上述標(biāo)準(zhǔn)在2019年3-4月就診患者中另選取80例用于參考區(qū)間的驗證，其中男40例、女40例，年齡均為出生后3 d至14歲。

1.2儀器與試劑 采用美國BECKMAN-COULTER 公司的UniCel DxI800免疫分析系統(tǒng)(儀器序列號為602423；儀器系統(tǒng)號為1965899)，應(yīng)用四川省沃文特生物技術(shù)有限公司的降鈣素原質(zhì)控品及配套試劑盒(微粒子酶促化學(xué)發(fā)光法，試劑批號為435699、配套定標(biāo)液批號為900101、效期：20200101)。按ISO 17511規(guī)定量值溯源至德國BRAHMS公司建立的第2代參考物質(zhì)PCT115。凍存血清統(tǒng)一復(fù)融，高速離心后取上層清液進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書進(jìn)行。

1.3收集方法 按說明書要求采集所有入選對象空腹靜脈血3 mL，1 400×g離心10 min分離血清，待完成其他生化檢測后分離收集剩余血清至1.5 mL尖底離心管中，按上述標(biāo)本剔除標(biāo)準(zhǔn)排除溶血、乳糜、黃疸等樣本，將收集到的樣本編號后放在試管架上保存于-80 ℃冰箱待測，過程中避免反復(fù)凍融，所有冷凍樣本僅在檢測前于室溫中復(fù)融1次。

1.4質(zhì)量保證 嚴(yán)格執(zhí)行室內(nèi)質(zhì)控程序，按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)的EP9-A2文件，采用四川沃文特生物技術(shù)有限公司的PCT質(zhì)控品(水平1批號為900101、水平2批號為900102、水平3批號為900103)進(jìn)行質(zhì)控。在進(jìn)行檢測前，對儀器進(jìn)行重新定標(biāo)，檢測3個水平的質(zhì)控品，確保在控。使用的儀器按照中國合格評定國家認(rèn)可委員會的要求校準(zhǔn)，性能驗證合格。在同一天8 h內(nèi)完成全部樣本檢測，避免天間變異。

1.5檢測原理 采用微粒子酶促化學(xué)發(fā)光法，即用已包被特異性抗體的無磁性微粒子作為固相載體與血清中的PCT發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，以堿性磷酸酶作為發(fā)光劑。

1.6參考區(qū)間驗證 檢測80例患者血清PCT水平，將檢測結(jié)果剔除離群值后，保證每組至少有20例樣本，計算R值。R=測定結(jié)果在參考區(qū)間內(nèi)的例數(shù)/總測定例數(shù)。如80例參考個體中不超過8例檢查結(jié)果落在所驗證的參考區(qū)間外(即R≥90%)，則可基本認(rèn)為該參考區(qū)間適用；如果有9例及以上的觀測值落在參考區(qū)間外，則證明該參考區(qū)間不適用。

2 結(jié) 果

2.1參考個體的一般實驗室檢測項目分析 400例參考個體分別測定了肝功常規(guī)、腎功常規(guī)、血脂常規(guī)、離子常規(guī)、尿常規(guī)、血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白等項目。其中白細(xì)胞計數(shù)(WBC)與C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測結(jié)果見表1。PCT檢測結(jié)果與相對應(yīng)的WBC和CRP結(jié)果分別進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(r<0.3，P>0.05)。說明在本研究參考人群中PCT水平越高，WBC與CRP結(jié)果也會相應(yīng)升高，但是二者的升降趨勢與PCT水平無必然聯(lián)系。同時在檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)出生后3 d至2歲患兒WBC較2～14歲患兒高，而紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)與后者相比較低。符合人民衛(wèi)生出版社第5版《臨床檢驗基礎(chǔ)》所描述的兒童血常規(guī)變化趨勢，即0～2歲兒童WBC升高明顯，2歲后WBC逐漸平穩(wěn)下降但始終稍高于成人。

表1 不同人群PCT、CRP與WBC檢測結(jié)果比較

2.2檢測系統(tǒng)性能評價 按照EP9-A2文件要求進(jìn)行檢測系統(tǒng)性能評價，結(jié)果顯示，檢測系統(tǒng)的批內(nèi)精密度、批間精密度、重復(fù)性、回收率、線性范圍、靈敏度、攜帶污染率等性能指標(biāo)均符合臨床使用要求。

2.3離群值判斷 將所有檢測對象的PCT檢測結(jié)果按年齡升序排列后，疑似最大離群值為0.96 ng/mL，以其計算D/R值為0.185，小于1/3，故保留所有檢測數(shù)據(jù)。

2.4參考個體PCT水平的比較 按照年齡對納入的參考個體進(jìn)行分組，經(jīng)非參數(shù)秩和檢驗分析，發(fā)現(xiàn)不同組間檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡段參考個體PCT檢測結(jié)果以M(Q1，Q3)表示，3 d至1歲、1～<2歲、2～<4歲，4～<6歲、6～<8歲、8～<10歲、10～<12歲、12～≤14歲患者均為50例，其PCT水平分別為[0.140(0.100,0.230)ng/mL]、[0.190(0.150,0.375)ng/mL]、[0.175(0.140,0.288)ng/mL]、[0.170(0.133,0.310)ng/mL]、[0.135(0.103,0.238)ng/mL]、[0.145(0.110,0.260)ng/mL]、[0.130(0.100,0.238)ng/mL]、[0.130(0.070,0.210)ng/mL。同樣217例男性與183例女性兒童PCT檢測結(jié)果分別為[0.160(0.110,0.280)ng/mL]和[0.160(0.110,0.280)ng/mL]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.283)。

2.5正態(tài)性檢驗 以所有檢測結(jié)果繪制頻數(shù)分布圖，使用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)性檢驗，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，見圖1。

圖1 出生后3 d至14歲人群PCT檢測數(shù)據(jù)頻數(shù)分布圖

2.6建立生物參考區(qū)間 結(jié)合400例納入對象PCT檢測結(jié)果頻數(shù)分布及PCT臨床意義，以95%分位數(shù)為上限確定生物參考區(qū)間，即以第380位數(shù)據(jù)為參考上限，建立本檢測系統(tǒng)的兒童PCT生物參考區(qū)間為PCT≤0.46 ng/mL。

2.7驗證生物參考區(qū)間 另選取的80例患者PCT檢測結(jié)果均通過驗證，即檢測結(jié)果落在本研究參考區(qū)間外的個數(shù)為0例(R值≥90%)，說明本研究建立的參考區(qū)間是適用且可被轉(zhuǎn)移的。

2.8與其他文獻(xiàn)報道結(jié)果比較 目前國內(nèi)涉及兒童PCT參考區(qū)間建立范圍僅有重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科研究報道的結(jié)果為PCT≤0.038 ng/mL，即健康兒童PCT水平≤0.038 ng/mL，較本實驗結(jié)論相比有較大的出入，其結(jié)果的統(tǒng)計分析同樣顯示PCT檢測結(jié)果在不同年齡和性別間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在國外研究中，也有少量間接涉及未成年人PCT的相關(guān)研究，與本研究結(jié)果較為符合，見表2。

表2 其他文獻(xiàn)報道的PCT參考區(qū)間

3 討 論

本研究嚴(yán)格遵守《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》中的要求，按照CLSI EP28-A3c文件，利用400例參考個體樣本的PCT測定結(jié)果和統(tǒng)計結(jié)果，調(diào)查了適用于出生后3 d至14歲人群的PCT生物參考區(qū)間，即PCT≤0.460 ng/mL，本結(jié)果明顯高于健康成年人的參考區(qū)間。

國內(nèi)大部分實驗室通常認(rèn)為成年人PCT質(zhì)量濃度的正常值應(yīng)為<0.050 ng/mL，與上述重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的研究結(jié)果顯示的兒童生物參考區(qū)間(≤0.038 ng/mL)沒有本質(zhì)上的區(qū)別。也有外國學(xué)者認(rèn)為成年人PCT水平≥0.25 ng/mL時即可確認(rèn)為細(xì)菌感染，建議使用抗菌藥物[22]。這些區(qū)間上限明顯低于本實驗所給出的結(jié)論，但是在不考慮儀器試劑等差異的情況下，參考區(qū)間也會受到生物所固有變異性、生活地區(qū)、生活水平影響而發(fā)生改變，不可能是一個固定的范圍。因此，與實驗預(yù)期相符，本研究與其他研究所報道的參考區(qū)間有一定符合也有一定差異，符合國外文獻(xiàn)的報道，但與重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院建立的參考區(qū)間相比較寬，可能與不同地區(qū)兒童飲食習(xí)慣差異有關(guān)，所以建議各實驗室依據(jù)不同臨床需求把前來本院就診的兒童當(dāng)做特殊人群，去建立符合其生理情況的準(zhǔn)確參考區(qū)間。同樣，本研究納入標(biāo)準(zhǔn)中采用的各年齡段血常規(guī)參考區(qū)間，也只能覆蓋95%人群，入選的參考個體WBC結(jié)果即便在參考區(qū)間內(nèi)，也不能確保不存在感染，所以本研究在分析參考人群血清PCT檢測結(jié)果的同時，對其WBC與CRP結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析，分析結(jié)果顯示三者之間無聯(lián)系，說明納入的人群不存在會使PCT水平上升的細(xì)菌感染，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確。經(jīng)大量研究確認(rèn)的是，新生兒的降鈣素原水平在出生后短期內(nèi)會生理性增高[23]，最高值可達(dá)21 ng/mL，平均值為2 ng/mL，所以國內(nèi)相關(guān)研究所納入的對象年齡最小也有7個月。但是相關(guān)文獻(xiàn)同樣表明，新生兒出生后3 d PCT水平便會下降并維持相對固定的水平，所以本研究填補(bǔ)了出生后3 d至半年兒童降鈣素原參考區(qū)間未有人涉及的空缺。其他研究的樣本量較小，年齡分組過于寬泛，未滿足《兒科學(xué)》第6版中推薦的7個年齡段，并且在建立好參考區(qū)間后也未進(jìn)行參考區(qū)間的驗證，本研究針對以上方面均做出了相應(yīng)改進(jìn)。

本研究也存在一定局限性：(1)兒童參考個體雖不易受吸煙、酗酒等不良嗜好的感染，但是本研究未針對兒童飲食習(xí)慣設(shè)定納入或排除標(biāo)準(zhǔn)，對于兒童的營養(yǎng)狀態(tài)也僅通過身高、體質(zhì)量及一部分實驗室檢查項目間接評估。(2)本研究采用的是回顧性采樣法，用于檢測PCT的血清是做完其他生化項目的剩余血清，有些樣本可能會在室溫或4～8 ℃冰箱中儲存一段時間，根據(jù)研究表明，在4 ℃保存12 h的血清PCT質(zhì)量濃度會下降6%[24]。(3)由于化學(xué)發(fā)光試劑昂貴，本研究經(jīng)費有限，所以樣本量僅有400例，無法再擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證，且男女比例也未能達(dá)到1∶1；無法再細(xì)化分組，不能調(diào)查PCT在胎兒期、新生兒期及嬰兒期是否存在差異。(4)今后應(yīng)在制定并遵守適用于出生3 d內(nèi)新生兒的納入標(biāo)準(zhǔn)的前提下，進(jìn)一步探究新生兒PCT的生物參考區(qū)間。(5)建立參考區(qū)間最重要的質(zhì)量保證就是檢測方法的溯源性，但PCT目前并不能按ISO 17511溯源至國際單位制(SI)，德國BEAHMS公司建立的PCT溯源鏈，其設(shè)定未考慮到年齡、性別、地域的差異，建立適當(dāng)?shù)膮⒖紖^(qū)間尚需要大量數(shù)據(jù)積累和相應(yīng)分析，只有排除潛在的干擾因素才能使生物參考區(qū)間具有廣泛的適應(yīng)性，覆蓋不同人群，滿足臨床需要。

針對以上不足，希望在未來有條件的時候，采用多中心、盲法的實驗設(shè)計；擴(kuò)大有效樣本量；對不同地域進(jìn)行分組；用諾爾曼PCT檢測系統(tǒng)對出生3 d內(nèi)嬰兒末梢血檢測，從而建立起與兒童人群免疫系統(tǒng)正常發(fā)育規(guī)律相符合的生物參考區(qū)間。

4 結(jié) 論

本研究成功地在更大范圍上更精準(zhǔn)地建立了出生后3 d至14歲兒童PCT生物參考區(qū)間。發(fā)現(xiàn)了兒童PCT水平與成人有較大差別，評估兒童感染狀況時不能以成人參考區(qū)間作為依據(jù)。有助于兒童感染性疾病的診斷、輔助用藥及預(yù)后觀察，為完善地建立兒童實驗室檢查項目的參考區(qū)間進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。