李卓敏，張牧之，王曉寧，劉 晴，鄭芳芳，古 媛，韓 旭，田 野，聶秋燕，張然星，閆惠平，譚延國△

(1.首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院檢驗科，北京 100038；2.首都醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學系，北京 100038；3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院檢驗科，北京 100102；4.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫研究中心，北京100061)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種原因未明的慢性膽汁淤積性疾病，患者以堿性磷酸酶(ALP)和γ-谷丙酰轉肽酶(GGT)升高為主，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)或天門冬氨酸基轉移酶(AST)及免疫球蛋白(主要為IgM)可見中等程度升高，膽紅素升高、清蛋白下降、凝血酶原時間(PT)延長常為疾病進展的表現。PBC的發(fā)病機制尚不明確，但遺傳易感性及環(huán)境因素是其主要發(fā)病機制之一[1]。已有研究表明，PBC患者受累膽管周圍伴隨淋巴細胞浸潤，可見CD4+T、CD8+T細胞及B細胞，而且在PBC患者外周血及受累膽管周圍均已被證實有丙酮酸脫氫酶復合體E2(PDC-E2)抗原特異性的CD4+的自身反應性T細胞的存在。CD4+CD25+T細胞具有免疫抑制功能，可抑制自身反應T細胞的增殖。很多學者提出PBC患者自身反應T細胞與免疫調節(jié)性T細胞(Treg)的失衡，可能是PBC的致病因素之一。本研究分析PBC患者外周血CD4+T細胞、Treg水平與肝功能指標的相關性，重點探討不同臨床分期及治療前后PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+調節(jié)T細胞在其病情進展及機體免疫平衡維持中的可能作用，以嘗試從免疫調節(jié)角度為PBC的早期治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2009年6月至2013年12月于北京佑安醫(yī)院初次住院治療且后期隨訪依從性較好36例PBC患者(PBC組)，選取該36例患者隨訪過程中(治療時間均大于或等于12個月)不同時間點標本進行下述研究。研究對象符合2009年美國肝病學會(AASLD)制定的PBC診斷標準，同時排除病毒性肝炎，酒精性及藥物性肝損害[2]。健康對照組均為北京佑安醫(yī)院及首都醫(yī)科大學的健康獻血志愿者，共計15例。所有標本的采集均符合北京佑安醫(yī)院科研倫理委員會要求且已簽署知情同意。

1.2儀器與試劑 熒光抗體抗CD4-FITC、抗CD25-percp和FoxP3-PE購自BD公司，RPM1640培養(yǎng)基購自北京Hyclone公司，二亞基甲砜(DMSO)及胎牛血清(PBS)購自Sigma公司。流式細胞儀FACS Calrbar為BD公司產品。

1.3方法

1.3.1淋巴細胞懸液的制備 乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管分別采取不同時間段患者的外周靜脈血且在6 h內進行實驗，用淋巴細胞分離液按說明書步驟分離淋巴細胞，以RPM1640離心洗滌細胞2次，加入細胞凍存液(DMSO∶PBS=1∶9)后調節(jié)細胞濃度，分裝凍存入液氮以備用。

1.3.2細胞染色 提取適宜細胞迅速入37 ℃水浴箱進行復蘇，轉移至10 mLR10(RPMI1640∶PBS=9∶1)中離心棄上清，以5 mL R10重懸后計數細胞及存活率(10 μL細胞懸液及10 μL 2%臺盼藍混合)，37 ℃孵箱培養(yǎng)。取培養(yǎng)的細胞，加PBS調節(jié)濃度為107/mL后加100 μL入BD流式管中同時加入CD4及CD25抗體各5 μL，避光染色20 min后PBS洗滌離心棄上清，加入Fix/Perm液1 mL破膜后加入FoxP3抗體2.5 μL染色30 min，PBS洗滌后2%多聚甲醛固定，待測。

1.3.3流式細胞儀檢測及分析 染色后細胞在流式細胞儀上檢測，用Cell Quest軟件獲取數據后然后分別用Cell Quest及Flowjo軟件分析結果。

2 結 果

2.1流式實驗分析不同組別間CD4+T細胞及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平 比較36例隨訪依從性較好PBC患者治療前時間點細胞與15例健康對照外周血單個核細胞中CD4+T細胞及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平，可見PBC患者在熊去氧膽酸治療前表達CD4+CD25+FoxP3+Treg水平顯著低于健康對照組，CD4+T細胞數量未見顯著變化，見表1。

表1 兩組CD4+T及CD4+CD25+FoxP3+Treg水平比較

注：*表示治療前的例數

2.2CD4+T細胞、Treg水平與血清生化指標相關性分析 36例治療前PBC患者的CD4+T細胞、Treg水平與相應時間點的血清生化值的相關性見表2，可見PBC患者外周血Treg水平與ALP(r=0.257、P=0.03)、IgM(r=0.241、P=0.045)等生化指標呈正相關；CD4+T細胞水平僅與年齡呈負相關(r=-0.252，P=0.033)。

2.3不同臨床階段PBC患者及治療前后Treg水平比較分析 根據文獻[3]將PBC患者分為4個階段，第1階段：無臨床癥狀且生化檢查正常，AMA陽性，病理上有PBC表現；第2階段：無臨床癥狀但可見肝臟生化異常；第3階段：出現臨床癥狀，如乏力、瘙癢等；第4階段：出現肝功失代償征象。因第1階段的PBC患者在臨床較難發(fā)現，故本研究中的36例患者分別涵蓋第2階段(9例)、第3階段(17例)、第4階段(10例)患者，經方差分析可得，第2階段患者Treg水平[(3.88±1.70)%]顯著高于第3階段患者[(2.66±1.13)%]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各階段PBC患者熊去氧膽酸治療前后Treg%比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4不同療效PBC患者治療前后Treg水平比較 巴塞羅那標準判斷患者應答狀況：PBC患者經過熊去氧膽酸治療1年后ALP下降40%或降至正常值范圍說明患者對熊去氧膽酸應答較佳[4]。根據該標準將36例PBC患者分為無應答組18例，應答良好組18例。經分析后可見不同療效PBC患者組內及組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3，似乎可認為熊去氧膽酸治療對PBC患者體內Treg%可能無太大影響。

表2 CD4+T細胞、Treg水平與生化指標相關性分析

表3 不同療效PBC治療前后CD4+T及Treg水平變化

3 討 論

自1995年日本學者SAKAGUCHI等[5]首次報道CD4+CD25+Treg細胞以來，很多學者投入到這類細胞的研究中并且取得了豐碩成果。FoxP3是目前公認的CD4+CD25+Treg的特異性標志[6]。CD4+CD25+T細胞具有免疫抑制性，可抑制CD4+T、CD8+T等增殖反應及殺傷功能，從而抑制機體自身免疫反應、維持免疫穩(wěn)定。PBC患者由于環(huán)境、遺傳等因素影響胸腺內CD4+CD25+T細胞的產生,外周血中CD4+CD25+T細胞數量減少,其抑制功能受到嚴重削弱,因而產生Th1細胞驅動的有害自身免疫應答。LAN等[7]研究在PBC患者中FoxP3+Treg數量相對減少，提示其在FoxP3+Treg細胞免疫耐受缺乏。許茵等[8]及CICHOZ-LACH等[9]研究也指出PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg調節(jié)性T淋巴細胞減少，免疫抑制功能減弱，對評估PBC患者細胞免疫狀態(tài)和預后有重要價值。本研究中結果與上述學者研究結果類似。

有研究報道Treg細胞比例降低會促使膽管上皮細胞表達IL-17受體，與體內IL-17結合后會促進多種炎癥因子的釋放，加劇炎性反應，這可能是其致病機制所在[10]。本研究還顯示，Treg水平似乎能夠對臨床分期為Ⅱ、Ⅲ期的PBC患者進行區(qū)分，但總體而言區(qū)分能力不強。

本研究中未治療的PBC患者，其自然病程中Treg水平與ALP及IgM水平呈正相關(r=0.257、P=0.03，r=0.241、P=0.045)，這與其他研究報道結果一致[10]，RONG等[11]認為PBC患者Th17細胞、Treg細胞及相應細胞因子的異常參與自身免疫耐受的打破，在損害膽管上皮細胞中起著重要作用，同時PBC繼發(fā)肝內膽管炎，導致肝臟合成TB、ALP、GGT等經膽道排泄異常。本研究后期尚需要加大病例數、細化治療前PBC患者的臨床分期和病理分期后進行進一步研究，方能得出一個更為可靠的結論。

熊去氧膽酸是目前被美國FDA批準用于PBC治療的唯一藥物，在體外實驗中熊去氧膽酸被證實可抑制免疫球蛋白和細胞因子的產生、抑制淋巴細胞增殖及CD4+T淋巴細胞調節(jié)的靶細胞凋亡[12]。熊去氧膽酸治療可使PBC患者血清膽紅素及ALP、GGT等降低，肝功能恢復正常，臨床癥狀基本緩解，使具有調節(jié)作用的CD4+CD25+T細胞逐漸恢復正常水平，本研究中僅可見升高趨勢，可能與患者差異及選擇例數較少有關，期待后期擴大樣本量繼續(xù)觀察。

本實驗初步研究PBC患者外周血CD4+CD25+FoxP3+T細胞在不同階段及治療前后水平比較，提示Treg細胞可能通過抑制體內T細胞活化來延緩病情發(fā)展和減輕肝功能損傷，故今后PBC患者除早發(fā)現早治療外，有望通過刺激機體產生Treg細胞來達到治療效果。

4 結 論

PBC患者與健康者對比可見外周血Treg水平顯著降低且與ALP、IgM等生化指標呈正相關，且患者疾病早期體內Treg水平顯著高于其他分期。熊去氧膽酸治療似乎不影響患者體內Treg水平，僅可見應答良好患者中呈現輕微上升趨勢。