劉 慧 李松蓮 譚程丹 凌 潔 黃維芳 劉麗芳

1湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007 2湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410207

乳腺增生是女性最常見的乳房疾病，臨床表現(xiàn)為一側(cè)或兩側(cè)乳房結(jié)節(jié)、乳腺增大、局部周期性疼痛等，多見于30～50歲女性，男性也可發(fā)生。不典型增生屬于乳腺高危病變，其發(fā)生乳腺癌的危險性明顯增加[1]。乳腺增生的發(fā)生，本質(zhì)上是由于乳腺主質(zhì)和間質(zhì)不同程度地增生與復舊不全所致的乳腺正常結(jié)構(gòu)紊亂，可能與卵巢功能失調(diào)有關，也可能為黃體素與雌激素比例不平衡所致，目前尚無定論，多認為與體內(nèi)內(nèi)分泌紊亂及激素水平失調(diào)有關。西醫(yī)主要采取激素類藥物治療，易反復而難治愈，或手術切除增生腫塊，增加患者的精神負擔。乳痛軟堅片是本院院內(nèi)制劑，已經(jīng)在臨床上使用多年，成分穩(wěn)定[2]，療效確切。本研究將進一步從激素水平探討其治療乳腺增生的作用機理，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只健康未孕雌性SD大鼠，SPF級，70～80日齡，體重180～230 g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號SCXK(湘)2009-0012。全價顆粒飼料由湖南中醫(yī)藥大學提供，批號100811。

1.2 藥物

乳痛軟堅片，由柴胡、陳皮、川楝子、延胡索、莪術、當歸、白芍、黨參、浙貝母、海蛤粉、甘草等中藥組成，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室制備(規(guī)格0.3 g×100片，湘藥制字Z20160364，批號161009)。紅金消結(jié)濃縮丸，由金蕎麥、三七、五香血藤、柴胡、八角蓮、大紅袍、香附、鼠婦蟲、黑螞蟻、雞矢藤等中藥組成，云南楚雄云中制藥有限公司(規(guī)格0.2 g×60丸，國藥準字Z20160511，批號160514)。黃體酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國藥準字H12020534，批號1612091)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸有限公司，國藥準字H12020529，批號1605061)。

1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：大鼠雌激素ELISA檢測試劑盒(美國DRG，批號JKSJ-2636)；大鼠孕激素ELISA檢測試劑盒(cusabio，批號CSB-E07282r)；大鼠泌乳素ELISA檢測試劑盒(武漢純度生物，批號CD-108818-ELISA)；磷酸緩沖鹽溶液、枸櫞酸鈉緩沖液均由博士德提供；無水乙醇、蘇木素、鹽酸、二甲苯、多聚甲醛、0.9%NaCl注射液等均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：三目生物顯微鏡(Carl Zeiss 3120000469)，電子天平(WTI1001R)，圖像分析系統(tǒng)(Motic Images Advanced 3.2)，生物組織自動脫水機，生物組織包埋中心，石蠟切片機(DQP-9010)，攤片烤片機，微波爐，電子恒溫水浴箱，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫電烤箱，自制大鼠灌胃器，鑷子，自制大鼠固定器，試管架，蓋玻片，移液器等。

1.4 動物模型的制備

60只SD大鼠，自由進水、進食，12 h明暗交替，室溫20℃～23℃，相對濕度55%，適應性喂養(yǎng)1周，適應環(huán)境后開始實驗。正常對照組(A組10只)大鼠大腿外側(cè)肌注0.9%NaCl注射液(0.5 mg/kg)，1次/d，連續(xù)30 d。參照文獻[3]制備乳腺增生肝郁痰凝型大鼠模型，模型制備組(50只)肌注苯甲酸雌二醇注射液(0.5 mg/kg)，1次/d，持續(xù)25 d；接著肌注黃體酮注射液(4 mg/kg)，1次/d，持續(xù)5 d；模型制備組同時予以每日夾尾(距尾巴末梢25 cm的地方)刺激30 min，共30 d。

造模后，模型動物出現(xiàn)性情改變，毛色枯黃，體重增加減慢甚至停滯等現(xiàn)象；肉眼觀察，模型動物的乳頭高度及直徑、乳房毛發(fā)裸露區(qū)直徑明顯大于正常對照組；隨機抽取10只模型制備組大鼠、2只正常對照組大鼠，取大鼠的前1對或2對乳房做病理切片，光鏡下顯示模型制備組較正常對照組大鼠乳腺小葉數(shù)目增多、腺泡明顯擴張等乳腺增生病理改變，血清雌激素水平顯著升高等，表示造模成功。

1.5 動物干預方法

對造模成功的大鼠進行隨機均衡分組，A組仍為正常對照組，B組為模型對照組，實驗組設C、D、E組分別為乳痛軟堅片低、中、高劑量組，F(xiàn)組為紅金消結(jié)濃縮丸陽性對照組，每組8只大鼠。乳痛軟堅片中劑量組換算為臨床日用量等效劑量，低、中、高劑量組按1：2：4比例用藥，分別為0.32 g/kg、0.64 g/kg、1.28 g/kg；F組給藥劑量為0.55 g/kg。藥物研末，分別稱取，用蒸餾水溶解稀釋，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。A、B組大鼠灌以10 mL/kg的生理鹽水，C、D、E、F各組每日以10 mL/kg的藥物溶劑灌胃，連續(xù)灌胃1個月。實驗結(jié)束時，各組大鼠均成活。

1.6 檢測指標及方法

①大鼠行為學指標 觀察大鼠是否存在“皮毛欠光、豎毛、脫毛、弓背、怕冷、倦怠、反應遲鈍、易激惹、急躁”等反應，分別按“無、輕微、明顯”計0、1、2分[4]；9項總分為0～5分者終得分計為0分，6～11分者終得分計為1分，12～18分者終得分計為2分。

②乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑 對大鼠乳房外形進行觀察，用游標卡尺對雙側(cè)第2對乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑進行精確測量。

③血清E2、P、PRL水平 于末次給藥后1 h，大鼠尾靜脈采血，離心取血清，分裝后冷凍保存，采用酶聯(lián)免疫分析方法，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行實驗操作，檢測血清E2、P、PRL水平。

④乳腺病理觀察 脫頸椎處死大鼠，用20%Na2S脫毛，取大鼠第2、3對乳房，分別用10%福爾馬林固定24 h；經(jīng)過脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、烤片、HE染色等處理后進行鏡檢。光鏡下觀察乳腺組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)，利用圖像分析軟件采集圖像并測量乳腺導管上皮細胞層數(shù)，每張病理切片觀測3個視野后取其平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學評分及乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑

造模后，與A組比較，B、C組大鼠行為學評分顯著升高(P<0.05)。治療后，與B組比較，D、E、F組大鼠行為學評分明顯降低(P<0.05)；與C組比較，D、E、F組大鼠行為學評分明顯降低(P<0.05)。

造模后，與A組比較，B、C、D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑均顯著增大(P<0.05)。治療后，與B組比較，D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)；與C組比較，D、E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)；與D組比較，E、F組大鼠乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯縮小(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學評分及乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05；與D組比較，□P<0.05

2.2 乳腺導管上皮細胞增生層數(shù)

造模后，B組大鼠乳腺導管上皮細胞增生層數(shù)明顯多于A組(P<0.05)；治療后，E組大鼠乳腺導管上皮細胞增生層數(shù)明顯少于B組(P<0.05)。見表2。

表2 乳腺導管上皮細胞增生層數(shù)

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

2.3 血清E2、P、PRL水平比較

造模后，B組大鼠血清E2、PRL水平明顯高于A組，血清P水平明顯低于A組(P<0.05)；治療后，D、E、F組大鼠血清E2水平顯著低于B組(P<0.05)，F(xiàn)組大鼠血清P水平顯著高于B組(P<0.05)，E、F組大鼠血清PRL水平顯著低于B組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清E2、P、PRL水平比較

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

3 討論

多數(shù)學者認為，乳腺增生與下丘腦-垂體-卵巢-乳腺內(nèi)分泌軸紊亂有關，雌、孕激素比例失調(diào)使乳腺在雌激素的刺激下實質(zhì)增生過度和復舊不全[5]，而PRL水平長期升高不僅可直接刺激腺泡增生，還可通過刺激雌激素的產(chǎn)生及對孕激素的抑制從而導致乳腺腺體增生[6]。枸櫞酸他莫昔芬片為一種雌激素受體拮抗劑，結(jié)構(gòu)類似雌激素，能與E2競爭雌激素受體并形成穩(wěn)定復合物，導致雌激素無法發(fā)揮作用，雖可應用于治療乳腺增生、預防乳腺癌，但不良反應較多而難以被患者接受[7]。

情志因素所導致的肝氣不舒是肝郁氣滯型乳腺增生疾病發(fā)生的最主要原因，其主要機理為肝郁氣滯，日久痰凝血瘀，形成增生結(jié)節(jié)伴疼痛。乳痛軟堅片是本院經(jīng)典制劑，具有疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功，成分穩(wěn)定，療效確切，并具有降低大鼠乳腺增生組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達，抑制新生血管形成，降低微血管密度(MVD)，改善腺體微循環(huán)及病理性增生的作用[8]。其基本藥物組成為柴胡、陳皮、川楝子、延胡索、當歸、白芍、莪術、海蛤粉、浙貝母、黨參、甘草等。柴胡解表退熱、疏肝解郁，陳皮理氣健脾、燥濕化痰，川楝子行氣止痛，延胡索活血、行氣、止痛，當歸補血調(diào)經(jīng)、活血止痛，白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛、平抑肝陽，莪術破血行氣、消積止痛，海蛤粉清肺化痰、軟堅散結(jié)，浙貝母清熱化痰、散結(jié)消癰，黨參補脾肺氣、補血生津，甘草補脾益氣、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和藥性；全方配伍，共奏疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功。

本研究結(jié)果表明，造模后大鼠出現(xiàn)“倦怠、弓背、怕冷、豎毛、皮毛欠光、脫毛、反應遲鈍、易激惹、急躁”等行為學表現(xiàn)，行為學評分顯著升高；肉眼觀察大鼠乳房可見乳頭周圍毛發(fā)裸區(qū)直徑明顯變大并隆起；乳腺組織可見到典型的乳腺增生灶，導管上皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂、增生層數(shù)明顯增多；血清E2、PRL水平明顯升高，血清P水平明顯降低，表明肝郁痰凝型乳腺增生大鼠造模成功。治療后，大鼠行為學評分下降，乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑縮小，乳腺導管上皮細胞排列基本規(guī)則、增生層數(shù)減少，血清E2、PRL水平降低，血清P水平升高，表明乳痛軟堅片干預后均出現(xiàn)不同程度的改善。本課題組前期臨床觀察[9]、徐玲[10]等研究發(fā)現(xiàn)疏肝活血藥物可改善患者性激素水平，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，乳痛軟堅片干預肝郁痰凝型乳腺增生大鼠可降低行為學評分，縮小乳房毛發(fā)裸區(qū)直徑，減少乳腺導管上皮細胞增生，降低血清E2、PRL水平，升高血清P水平，且高劑量乳痛軟堅片療效更為顯著。