陳麗嫦 于化鵬 吳玲玲 曾冠盛

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院,廣州 510280)

NLRC4炎癥小體(NLR family,CARD domain containing4，NLRC4)是一種多蛋白復(fù)合體，由N-端的含有胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(Caspase recruitment domain，CARD)，中間的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide binding oligomerization domain，NOD)和富含亮氨酸的C-端蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域(Leucine rich repeats，LRR)構(gòu)成。在過(guò)去的10余年里，研究發(fā)現(xiàn)炎癥小體的活化能夠激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1，CASP1)，使無(wú)活性CASP1前體(pro-CASP1)切割為有活性CASP1，從而促進(jìn)無(wú)活性的IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)切割為成熟的IL-1β和IL-18，釋放到胞外參與機(jī)體炎癥及損傷等過(guò)程[1-3]。目前已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體包括NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP7、NLRP12、NLRC4以及NAIP[4]。本文就NLRC4炎癥小體的構(gòu)成、活化機(jī)制以及其在感染和自身炎癥性疾病中的作用作一概述。

1 NLRC4炎癥小體的結(jié)構(gòu)特征

NLRC4的LRR結(jié)構(gòu)域由15個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，共440個(gè)氨基酸組成。因每個(gè)結(jié)構(gòu)單元之間與一個(gè)含有8～15個(gè)氨基酸的螺旋結(jié)構(gòu)連接，故而被稱為富含亮氨酸的重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)域用于識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)等配體；NOD結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏AA+ATP酶的超家族，可介導(dǎo)NLRC4自身寡聚反應(yīng)；CARD結(jié)構(gòu)域通常為由NLRC4的前94個(gè)氨基酸組成，其折疊成六個(gè)反向平行的α-螺旋包裹在疏水核心周圍，可連接銜接蛋白ASC及效應(yīng)分子CASP1，介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

Hu等[5]對(duì)在鼠巨噬細(xì)胞數(shù)量足夠、活性良好的情況下所分離出缺乏CARD結(jié)構(gòu)域的NLRC4進(jìn)行晶體分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRR、NOD結(jié)構(gòu)域及占據(jù)NOD結(jié)構(gòu)域的二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)通過(guò)廣泛的分子內(nèi)相互作用以穩(wěn)定該單體結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究證實(shí)ADP近端關(guān)鍵殘基H443的突變可導(dǎo)致NLRC4寡聚化，從而促進(jìn)炎癥小體的活化。研究者們發(fā)現(xiàn)人類的NLRC4功能突變大多集中在ADP結(jié)合位點(diǎn)附近，這表明核苷酸結(jié)合或ATP水解是寡聚化和炎癥小體活化所必需。同樣的，ATP磷酸結(jié)合環(huán)(P-Loop)突變導(dǎo)致NLRC4不能誘導(dǎo)CASP1激活[6]。

NLRC4寡聚化結(jié)構(gòu)中存在單個(gè)Naip基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)，該基因表達(dá)產(chǎn)物可以將數(shù)個(gè)NLRC4分子組裝成盤(pán)狀炎癥小體，進(jìn)而激活CASP1，產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)[7]。該盤(pán)狀炎癥小體較單一NLRC4結(jié)構(gòu)活性更高，該活性主要通過(guò)在LRR與中央核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的聯(lián)合區(qū)域來(lái)體現(xiàn)。

2 NLRC4炎癥小體的活化機(jī)制

NLRC4的表達(dá)可通過(guò)腫瘤壞死因子(TNF-α)的刺激及p53活化而上調(diào)[8,9]。然而許多研究表明NLRC4表達(dá)的基礎(chǔ)水平已經(jīng)足以支持NLRC4炎癥小體在上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的活化。

Mariathasan等[10]發(fā)現(xiàn)NLRC4缺失的鼠類巨噬細(xì)胞在接觸沙門(mén)氏菌后，CASP1不能被激活。隨后有多項(xiàng)研究表明來(lái)自沙門(mén)氏菌及軍團(tuán)菌的鞭毛蛋白能夠誘導(dǎo)NLRC4介導(dǎo)的CASP1活化[11-13]。因此，研究者們認(rèn)為鞭毛蛋白在NLRC4介導(dǎo)的CASP1活化過(guò)程中不可或缺。然而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，雖然鞭毛蛋白缺失的沙門(mén)氏菌在感染早期不能激活CASP1，但在感染后期仍可監(jiān)測(cè)到CASP1的活化和IL-1β的分泌。Miao等[14]發(fā)現(xiàn)此時(shí)CASP1的激活依賴于沙門(mén)氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的表達(dá)。因此，NLRC4的激活劑主要為鞭毛蛋白及T3SS蛋白(包括針狀蛋白分子和桿狀蛋白分子)。小鼠Naip基因家族分子中的Naip5、Naip6通過(guò)識(shí)別鞭毛蛋白介導(dǎo)NLRC4炎癥小體的激活，而Naip1及Naip2分別通過(guò)T3SS針狀蛋白分子和桿狀蛋白分子介導(dǎo)NLRC4炎癥小體的激活[15]。人類雖沒(méi)有與小鼠相同的Naip基因，但其表達(dá)的Naip同源物可通過(guò)識(shí)別T3SS針狀蛋白分子、桿狀蛋白分子和鞭毛蛋白激活NLRC4炎癥小體[16-18](圖1)。然而，細(xì)菌配體是如何結(jié)合Naip從而激活炎癥小體的機(jī)制尚不清楚。

為了研究NLRC4炎癥小體活化的具體機(jī)制，Qu等[19]采用人工遺傳學(xué)改造的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌感染小鼠后可以誘導(dǎo)NLRC4第533位絲氨酸發(fā)生磷酸化修飾反應(yīng)，即使抑制CASP1的活性也不能阻止這種磷酸化反應(yīng)的發(fā)生，這說(shuō)明NLRC4的磷酸化修飾反應(yīng)位于CASP1切割的上游。此外，研究還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶Cδ(Protein kinase Cδ，PKCδ)和p21活化激酶2(P21-activated kinase2，PAK2)都是參與NLRC4磷酸化修飾反應(yīng)的磷酸激酶。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)與帕金森癥和克羅恩病相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)序列激酶2(Leucine-rich repeat kinase 2 gene，LRRK2)表達(dá)減少可導(dǎo)致NLRC4炎癥小體活化程度下降。然而在幽門(mén)螺旋桿菌中鞭毛蛋白能夠誘導(dǎo)NLRC4磷酸化，但不能激活NLRC4炎癥小體[21]。因此，單純的磷酸化不足以誘導(dǎo)NLRC4的活化。NLRC4磷酸化相關(guān)激酶的特性及其在NLRC4活化過(guò)程中是否發(fā)揮著主導(dǎo)作用尚未清楚，但大量研究表明確保NLRC4的活化是抵御感染的關(guān)鍵部分。

3 NLRC4炎癥小體的效應(yīng)機(jī)制

最初研究者們認(rèn)為NLRC4通過(guò)激活CASP1，從而促進(jìn)pro-IL-1β及pro-IL-18轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訧L-1β及IL-18，引起炎癥反應(yīng)。隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)NLRC4下游存在幾種不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。CASP1還可以激活一種被稱為Gasdermin-D的胞質(zhì)蛋白，該蛋白經(jīng)切割后的N-末端結(jié)構(gòu)域作用在宿主細(xì)胞膜上，導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，并最終誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)[22]。與細(xì)胞凋亡不同，細(xì)胞焦亡的發(fā)生速度更快，IL-1β及IL-18等炎癥因子可通過(guò)Gasdermin-D形成的膜孔釋放到細(xì)胞外，促進(jìn)機(jī)體抵御病原體(圖1)。除此之外，Moltke等[23]研究發(fā)現(xiàn)一種人造鞭毛蛋白衍生的NAIP5-NLRC4激活劑通過(guò)激活鈣依賴性磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)釋放花生四烯酸。通過(guò)CASP1活化動(dòng)員的花生四烯酸促進(jìn)前列腺素和白三烯的快速合成。CASP1動(dòng)員花生四烯酸釋放的機(jī)制及該機(jī)制是否和NLRC4活化相關(guān)尚不清楚。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)確定了多達(dá)1 000個(gè)CASP1蛋白的潛在靶點(diǎn)，這表明除了上述信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，可能還有其他的下游信號(hào)對(duì)NLRC4炎癥小體介導(dǎo)的CASP1激活產(chǎn)生應(yīng)答。

圖1 NLRC4激活與效應(yīng)機(jī)制圖Fig.1 Triggering and effect mechanism of NLRC4Note:Four major groups of bacterial components trigger activation of the inflammasome.Flagellin and components of the type Ⅲ secretion system (T3SS) can be injected into the cytoplasm of the host cell via the T3SS.The T3SS needle and inner rod proteins are sensed by mouse NAIP1 and NAIP2,respectively,whereas flagellin is sensed by mouse NAIP5 or NAIP6.The needle and inner rod proteins and flagellin are all sensed by human NAIP.Ligand-bound NAIPs recruit NLRC4 to the same complex to drive activation of the NLRC4 inflammasome.NLRC4 acts as an adapter for caspase-1 activation.Caspase-1 cleaves the poreforming factor gasdermin D,whereby the N-terminal domain of gasdermin D forms pores in the host cell membrane.Caspase-1 also cleaves the proinflammatory cytokines pro-IL-1β and pro-IL-18,generating biologically active versions of these cytokines for release through the membrane pores generated by gasdermin D.The pores formed by gasdermin D also lead to lytic cell death via pyroptosis.

NLRC4的CARD結(jié)構(gòu)域可直接與pro-CASP1相互作用從而催化CASP1激活，凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein，ASC)在這一激活過(guò)程中起正性作用。其他構(gòu)成炎癥小體的蛋白(包括NLRP3，PYRIN和AIM2)亦可通過(guò)與ASC相互作用，進(jìn)而募集并誘導(dǎo)pro-CASP1裂解成為有活性的P10/P20四聚體，促使pro-IL-1β及pro-IL-18切割成活性形式并釋放到細(xì)胞外參與免疫應(yīng)答[24]。研究發(fā)現(xiàn)CASP8與CASP1類似，可促進(jìn)pro-IL-1β轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訧L-1β[25]。與CASP1不同的是，CASP8能在CASP1或Gasdermin-D被耗盡時(shí)引發(fā)CASP8依賴性細(xì)胞凋亡[26]。

4 NLRC4炎癥小體與鼠類宿主防御

Norlander等[27]發(fā)現(xiàn)感染檸檬酸桿菌后，Nlrc4-/-小鼠比野生型小鼠體重更輕，腸道炎癥的病理學(xué)特征(包括增生、白細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫)更明顯。另外，有實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予僅在腸道上皮細(xì)胞中特定表達(dá)NLRC4蛋白的實(shí)驗(yàn)小鼠注射純化后的細(xì)菌鞭毛毒素(Fla Tox)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于不表達(dá)NLRC4蛋白的老鼠，表達(dá)NLRC4蛋白的小鼠炎癥反應(yīng)更重，細(xì)菌數(shù)要更少[28]。Sellin等[29]證實(shí)小鼠腸上皮細(xì)胞Naip1-6組織特異性缺失可使感染早期沙門(mén)氏菌細(xì)菌負(fù)荷增加，這表明將沙門(mén)氏菌感染的腸上皮細(xì)胞排出到腸腔中取決于腸上皮細(xì)胞NAIP蛋白的表達(dá)。以上研究表明NAIP-NLRC4炎癥小體在控制腸道感染的細(xì)菌病原體中發(fā)揮了重要的作用。

盡管對(duì)于NLRC4的研究主要集中在腸道感染及腸道病原體上，近年研究發(fā)現(xiàn)NLRC4也與非腸道感染相關(guān)。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的鞭毛蛋白可激活NLRC4，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[30]。Balakrishnan等[31]發(fā)現(xiàn)機(jī)體在感染銅綠假單胞菌后，可通過(guò)T3SS組分激活NLRC4炎癥小體，引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)。而且NLRC4可以抵御非鞭毛桿菌如肺炎克雷伯菌[32]。這些非腸道病原體通過(guò)類似于沙門(mén)氏菌和志賀氏菌等腸道病原體激活NLRC4的典型機(jī)制(通過(guò)鞭毛蛋白或細(xì)菌T3SS的組分)激活NLRC4。此外，一些病原體(如立克次體)可通過(guò)環(huán)氧合酶2(Cyclooxyg-enase-2，COX2)介導(dǎo)的前列腺素合成的機(jī)制誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRC4活化[33]。

5 NLRC4炎癥小體與人類自身炎癥性疾病

NLRC4在鼠類宿主防御機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，前文提及人Naip可通過(guò)識(shí)別T3SS針狀蛋白分子激活NLRC4炎癥小體，我們推測(cè)NLRC4在人類細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌感染及清除中也扮演著不可或缺的角色。然而，關(guān)于NLRC4在現(xiàn)代人類機(jī)體中清除病原體的相關(guān)研究仍待進(jìn)一步完善，且目前尚無(wú)人類NLRC4功能喪失的相關(guān)研究。

研究者們發(fā)現(xiàn)NLRC4在驅(qū)動(dòng)人類自身炎癥性疾病(Autoinflammatory disease，AID)中也發(fā)揮著重要作用。自身炎癥是指不歸因于感染、惡性腫瘤或抗原特異性自身免疫的全身或器官特異性炎癥[34]，其最初范疇是圍繞自發(fā)性或增強(qiáng)的炎癥小體活化相關(guān)的可以阻斷IL-1β的單基因疾病，自1999年McDermott等[35]提出后，這個(gè)概念現(xiàn)已擴(kuò)展為包括數(shù)量驚人的疾病，其中許多是因?yàn)椴贿m當(dāng)?shù)难装Y小體激活所致。

經(jīng)過(guò)10余年對(duì)PYRIN和NLRP3炎癥小體以及相關(guān)自身炎癥性疾病如家族性地中海熱(Familial mediterranean fever，F(xiàn)MF)和冷炎素相關(guān)周期熱綜合征(Cryopyrin-associated periodic syndromes，CAPS)的深入研究，NLRC4相關(guān)自身炎癥性疾病于2014年被首次提及。研究表明NLRC4基因功能獲得性突變所導(dǎo)致自發(fā)/增強(qiáng)炎癥小體的異?；罨且鹦盒∧c結(jié)腸炎和復(fù)發(fā)性巨噬細(xì)胞活化綜合征(Macrophage activation syndrome，MAS)的原因[36,37]。

MAS是一種以急性發(fā)熱、全血細(xì)胞減少、肝膽功能障礙、凝血功能障礙及血清鐵蛋白持續(xù)升高為特征的綜合征[38]，臨床上類似于致命的嗜血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥，通常被歸類于免疫缺陷。其是兒童慢性風(fēng)濕性疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，通常使風(fēng)濕性疾病特別是全身型幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(systemic juvenile idiopathic arthritis，sJIA)和成人斯蒂爾病(Adult onset still′s disease，AOSD)復(fù)雜化。盡管IL-1β和IL-18在骨髓細(xì)胞中表達(dá)并在活化的炎癥小體參與下成熟并釋放到胞外，但在發(fā)現(xiàn)NLRC4-MAS之前，感染性疾病患者的血清中并未檢測(cè)到大量的IL-1β和IL-18。相反在sJIA和AOSD，尤其是MAS患者中可檢測(cè)到極高水平的IL-18[39,40]。因此，盡管NLRC4與感染性疾病及MAS均相關(guān)，但I(xiàn)L-18的高水平似乎只與后者相關(guān)。且患有難治性重癥MAS的患者在使用IL-18阻斷劑及γ干擾素阻斷劑(一種與IL-18誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子)后療效較好[41]。這表明IL-18可能是炎癥性疾病的潛在靶標(biāo)。

不同于其他炎癥腸病，NLRC4相關(guān)小腸結(jié)腸炎病例均發(fā)生在嬰兒早期，其炎癥可波及從胃到結(jié)腸的整個(gè)腸道，病變發(fā)生在十二指腸的患者癥狀較輕。NLRC4相關(guān)小腸結(jié)腸炎患者的腸道活組織檢查和尸檢結(jié)果均表現(xiàn)為混合的炎癥浸潤(rùn)，伴有組織水腫、上皮糜爛和組織自溶[42,43]。目前研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與NLRC4基因突變相關(guān)，常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為：V341A、T337S、T337N和S171F[33,42,44,45]。第337和341位氨基酸均位于炎癥小體NOD結(jié)構(gòu)域中，NLRC4晶體分析表明第341位氨基酸在ADP轉(zhuǎn)化為ATP的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其突變可影響炎癥小體的活化過(guò)程[42]。337位氨基酸可通過(guò)與170位和173位相互作用以穩(wěn)定炎癥小體的ADP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)[33]。據(jù)推測(cè)，用苯丙氨酸代替171位絲氨酸可改變上述相互作用，從而影響炎癥小體活化，導(dǎo)致NLRC4相關(guān)小腸結(jié)腸炎發(fā)生。令人震驚的是盡管結(jié)腸炎嬰兒伴發(fā)MAS、血清IL-18水平維持在較高水平，但能從嬰兒期存活下來(lái)的患者的胃腸疾病可以痊愈[36,37]。因此，早期腸道定植可能會(huì)促進(jìn)NLRC4相關(guān)小腸結(jié)腸炎患者細(xì)胞因子產(chǎn)生，該疾病的自然消退可能與腸道成熟、腸道黏膜免疫及腸道菌群相關(guān)。NLRC4在腸道防御中的作用提示NLRC4和IL-18與腸道微生態(tài)及免疫穩(wěn)態(tài)之間存在復(fù)雜的相互作用。

除了MAS和小腸結(jié)腸炎，研究發(fā)現(xiàn)在患有FACS4(一種自身炎癥性疾病)的兒童體內(nèi)存在NLRC4突變體H443P[46]。Volker-Touw等[47]發(fā)現(xiàn)另一多種自身炎癥表型的家系(包括蕁麻疹和結(jié)節(jié)性皮疹、結(jié)膜炎、關(guān)節(jié)炎等)也與NLRC4的錯(cuò)義突變相關(guān)。血清IL-18在該家系成員中顯著升高。Kawasaki等[48]記錄了一位具有嚴(yán)重冷炎素相關(guān)周期熱綜合征臨床癥狀的患者，該患者具有新型NLRC4突變的體細(xì)胞嵌合體。因此，NLRC4與自身炎癥性疾病具有明確的聯(lián)系。NLRC4激活對(duì)類花生酸生成的特異性尚未在這些患者中進(jìn)行評(píng)估，但抑制環(huán)氧合酶在除輕度患者以外的所有治療中都療效不佳。

大量研究表明NLRC4突變的氨基酸位置與自身炎癥性疾病表型之間存在一定的相關(guān)性。Unal等[49]發(fā)現(xiàn)在1例患有sJIA和復(fù)發(fā)MAS的患兒中，其發(fā)生了W374X突變。H443P突變可增加NLRC4與SUG1和泛素化蛋白質(zhì)的相互作用，并最終在人肺上皮細(xì)胞系中驅(qū)動(dòng)CASP8依賴性細(xì)胞凋亡[50]。發(fā)生在核苷酸結(jié)合域(Nucleotide binding domain，NBD)內(nèi)的第171位及第177位突變分別導(dǎo)致子宮復(fù)發(fā)性巨噬細(xì)胞活化綜合征，胎盤(pán)血栓形成及嚴(yán)重冷炎素相關(guān)周期熱綜合征，迄今為止公布的所有突變都發(fā)生在ADP/ATP結(jié)合位點(diǎn)附近[5]。目前，對(duì)于NLRC4參與免疫調(diào)控的機(jī)制研究主要集中在利用小鼠基因敲除模型證明NLRC4在各種細(xì)菌中激活CASP1的作用。NLRC4及相關(guān)信號(hào)通路在sJIA和AOSD等常見(jiàn)疾病及宿主防御方面的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

6 小結(jié)

盡管NLRC4炎癥小體相關(guān)的研究開(kāi)始較晚，但目前研究已為炎癥小體和自身炎癥疾病的關(guān)系提供了較為確切的依據(jù)。關(guān)于鼠NLRC4活性的微生物學(xué)和細(xì)胞免疫學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí)NLRC4在固有免疫宿主防御機(jī)制中的重要作用，并確定了其作用位點(diǎn)的調(diào)節(jié)途徑、調(diào)節(jié)機(jī)制(如磷酸化)、相互作用的對(duì)象(例如其他NLRs、CASP8)和效應(yīng)機(jī)制。為指導(dǎo)人類炎癥性疾病的預(yù)防和治療，NLRC4與人類炎癥性疾病的關(guān)聯(lián)，尤其是其與IL-18、MAS和嬰兒小腸結(jié)腸炎的獨(dú)特關(guān)聯(lián)需要更進(jìn)一步的研究。