景 雯 童 瑾

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,重慶 400010)

慢性氣道炎癥黏液高分泌時，杯狀細胞內(nèi)呈現(xiàn)異常擁擠狀態(tài)，而這種大分子擁擠環(huán)境有利于糖基附著于蛋白質(zhì)上從而提高蛋白的糖基化程度[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)的大分子擁擠環(huán)境會使介質(zhì)的黏度增加從而減少小分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)的擴散速率[2，3]。因此我們推測氣道杯狀細胞內(nèi)大分子擁擠推動高度糖基化MUC5AC的折疊和異常聚集從而發(fā)生分子構(gòu)象、組態(tài)的改變。目前關(guān)于體外模擬大分子擁擠環(huán)境，研究其對蛋白質(zhì)折疊和聚集影響作用的報道有很多，但尚未有關(guān)于MUC5AC糖基化在大分子擁擠環(huán)境中折疊和聚集效應(yīng)的研究，本實驗首次在大分子擁擠環(huán)境中研究了氣道MUC5AC折疊和聚集過程，進而驗證了大分子擁擠影響糖基化MUC5AC的錯誤折疊并加速其聚集。

1 材料與方法

1.1材料 pATX2表達載體、HEK-293細胞株、HEK-TF無血清培養(yǎng)基、Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒、膠回收試劑盒和糖苷酶PNGase F購自成都貝思迪生物有限公司；Ni-NTA 純化試劑盒購自Qiagen;鹽酸胍(GdnHCl)購自重慶衍慶生物；考馬斯亮藍 G-250、大分子擁擠試劑(BSA、Ficoll70、Dextran70、 PEG2000)和 Tris-HCl緩沖液均購自Sigma公司；PAS染色試劑盒(重慶葆光生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗中用于蛋白質(zhì)去折疊相關(guān)試劑配制的緩沖液均為10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。

1.2方法

1.2.1重組黏蛋白MUC5AC的表達和純化 首先利用PCR技術(shù)選擇性擴增了含有兩個糖基化位點的基因片段Mucin-5AC[5500-5654]，得到的MUC5AC cDNA片段經(jīng)EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后，再克隆入真核表達載體pATX2的兩酶切位點EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之間，在c-末端加上His標簽，形成重組表達載體 MUC5AC-pATX2，并轉(zhuǎn)染至HEK293細胞內(nèi)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)并誘導(dǎo)目的蛋白表達。表達產(chǎn)物用鎳離子親和層析柱進行純化，紫外分光光度計檢測蛋白濃度，并經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色確定蛋白純度和分子量大小[4,5]。

1.2.2去糖基化MUC5AC的制備 已知哺乳系統(tǒng)表達的MUC5AC具有兩個N-糖基化位點。因此可用PNGase F糖苷酶切除糖基[6]。每1 mg MUC5AC蛋白樣品中加入100 U(1 U/μl)的PNGase F，37℃水浴條件下酶切12 h，不加PNGase F的天然MUC5AC作為對照。分別將實驗組和對照組蛋白進行SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色分析分子量變化情況，并進行糖原染色(PAS染色)驗證去糖基化結(jié)果。

1.2.3天然MUC5AC(n-MUC5AC)、去糖基MUC5AC(d-MUC5AC)的變性和復(fù)性 Li等[7]在研究大分子擁擠環(huán)境對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6pDH)和蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶復(fù)性的影響時，使用了Ficoll70、Dextran70、PEG2000、BSA、卵清白蛋白和溶菌酶作為不同擁擠試劑，濃度梯度為0 g/L、50 g/L、100 g/L、150 g/L和200 g/L。因此本實驗利用BSA、Ficoll70、Dextran70和PEG2000作為擁擠試劑體外模擬四種不同的大分子擁擠環(huán)境。分別取15 μl n-MUC5AC和 d-MUC5AC溶液各自加入30 μl 6 mol/L鹽酸胍溶液，于室溫下變性1 h。將15 μl以上完全變性的蛋白溶液與585 μl 分別含有BSA、Ficoll70、Dextran70和PEG2000的Tris-HCl緩沖液混合進行復(fù)性處理，設(shè)置大分子擁擠試劑的終質(zhì)量濃度梯度ρ為50 g/L、100 g/L、200 g/L，用不含擁擠試劑的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)作為對照組[8]。

1.2.4復(fù)性動力學(xué)分析 蛋白質(zhì)的聚集采用濁度法則量，即25℃室溫條件下用紫外分光光度計連續(xù)監(jiān)測復(fù)性過程中蛋白質(zhì)在488 nm處吸光度的變化。每個時間點數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值并繪制復(fù)性動力學(xué)曲線。

2 結(jié)果

2.1重組MUC5AC在HEK-293細胞中的表達純化 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示獲得較純凈的目的蛋白(圖1),蛋白純度>90%,分子量約為40 kD。

圖1 重組MUC5AC在HEK293中的表達純化Fig.1 Expression and purification of recombinant MUC5AC in HEK293Note:A.Purification of the MUC5AC in HEK293 cell culture;IN.Supernatant;FT.The flow-through of the Ni-NTA column;W.The washing(PBS,pH7.5);E1-E11.The elution;M.Protein molecular weight marker；B.Purified human recombinant MUC5AC.Lane 1.The final protein sample.

2.2去糖基化結(jié)果分析 n-MUC5AC經(jīng)PNGase F糖苷酶去糖基化后經(jīng)SDS-PAGE檢測電泳條帶遷移情況如圖2所示。n-MUC5AC經(jīng)酶切后，分子量由40 kD下移至17 kD左右。PAS染色后僅n-MUC5AC在40 kD處顯色，酶切后的蛋白未見顯色，說明n-MUC5AC經(jīng)PNGase F糖苷酶消化后糖基基團已完全去掉。

圖2 染色分析MUC5AC去糖基化結(jié)果Fig.2 Staining analysis of MUC5AC glycosylation resultsNote:A.Coomassie brilliant blue staining;B.PAS staining.M.Protein molecular weight marker;L1.n-MUC5AC;L2.d-MUC5AC.

2.3大分子擁擠試劑對不同糖基化程度MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響 將15 μl完全變性的兩種蛋白溶液分別加入585 μl ρ為50 g/L、100 g/L、200 g/L的BSA、Ficoll70、Dextran70、 PEG2000的溶液中復(fù)性，用紫外分光光度計測定其在488 nm處光吸收度的變化，并與蛋白在對照緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl、pH8.0)中的復(fù)性結(jié)果做比較，蛋白的復(fù)性產(chǎn)率以復(fù)性結(jié)束后各蛋白吸光度值占天然MUC5AC吸光度值百分比表示，結(jié)果見圖3～5。變性的n-MUC5AC在稀溶液體系中的復(fù)性產(chǎn)率大約為變性前的75%(d-MUC5AC為80%)，而在ρ=200 g/L 的4種大分子擁擠試劑中，兩種變性的蛋白幾乎不能復(fù)性，復(fù)性產(chǎn)率僅為5%～10%；當ρ為50和100 g/L時，變性n-MUC5AC的復(fù)性產(chǎn)率可達50%～60%，變性d-MUC5AC的復(fù)性產(chǎn)率可達60%～70%。另外，由圖5可看出，在稀溶液體系中，變性的d-MUC5AC復(fù)性情況與n-MUC5AC相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在4種大分子擁擠試劑中，其復(fù)性產(chǎn)率均高于n-MUC5AC(P<0.05)。綜上，當大分子擁擠試劑的質(zhì)量濃度ρ選在50或100 g/L時兩種蛋白質(zhì)均能很好的復(fù)性，由于生物體內(nèi)的大分子濃度高達80～400 g/L[9-11]，因此后續(xù)實驗選用ρ=100 g/L作為最適質(zhì)量濃度。

圖3 不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對n-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of different mass concentrations of macromolecular crowding reagents on refolding yield of n-MUC5ACNote:*.P<0.05,**.P<0.01,vs 0 g/L macromolecular crowding reagents group(control group).

圖4 不同質(zhì)量濃度的大分子擁擠試劑對d-MUC5AC復(fù)性產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of different mass concentrations of macromolecular crowding reagents on refolding yield of d-MUC5ACNote:*.P<0.05,**.P<0.01,vs 0 g/L macromolecular crowding reagents group(control group).

圖5 兩種蛋白在稀溶液及相同濃度大分子擁擠環(huán)境中復(fù)性產(chǎn)率的比較Fig.5 Comparison of refolding yield of two proteins in dilute solution and macromolecular crowded environment with same concentrationNote:*.P<0.05,vs n-MUC5AC group(control group).

2.4兩種蛋白在不同擁擠環(huán)境中復(fù)性過程隨時間變化情況 兩種蛋白在稀溶液中復(fù)性產(chǎn)率隨時間變化情況相似，都經(jīng)歷了快-慢兩個階段：在前60 min內(nèi)蛋白復(fù)性產(chǎn)率可以恢復(fù)到天然蛋白的60%左右，60 min以后復(fù)性速率明顯減慢，90 min以后基本保持不變；而在4種擁擠試劑中的復(fù)性過程都轉(zhuǎn)變?yōu)榱寺?快-慢三個階段：前30 min內(nèi)，蛋白復(fù)性速率最緩慢，在30～150 min內(nèi)蛋白復(fù)性速率最快，150 min以后復(fù)性速率基本維持不變。統(tǒng)計結(jié)果顯示，4種擁擠試劑中兩種蛋白的復(fù)性速率與稀溶液相比明顯減慢,復(fù)性產(chǎn)率也降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。

圖6 兩種蛋白在對照緩沖液及擁擠環(huán)境中復(fù)性的時間變化曲線Fig.6 Curve of refolding time of two proteins in control buffer and crowded environmentNote:A.n-MUC5AC;B.d-MUC5AC;**.P<0.01,vs d-MUC5AC(control group).

2.5大分子擁擠對不同糖基化程度MUC5AC復(fù)性過程中聚集的影響 變性的MUC5AC在不同復(fù)性體系中聚集程度監(jiān)測結(jié)果如圖7，當大分子擁擠試劑的濃度一定(ρ=100 g/L)時，兩種蛋白在4種擁擠試劑中的聚集程度與緩沖液對照組相比顯著增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),含PEG2000的復(fù)性溶液中蛋白質(zhì)聚集程度最高，BSA中蛋白聚集程度次之，F(xiàn)icoll70和Dextran70中蛋白聚集程度相當，緩沖液對照組中的蛋白聚集程度最低。另外，在四種不同大分子擁擠試劑中，n-MUC5AC的聚集程度均比d-MUC5AC高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖7 大分子擁擠試劑對MUC5AC復(fù)性過程中聚集的影響Fig.7 Effects of macromolecular crowding reagents on aggregation during refolding of MUC5ACNote:**.P<0.01,vs dilute solution(control group)；#.P<0.05,vs n-MUC5AC(control group).

3 討論

MUC5AC是氣道黏液的主要成分[12]，主要由氣道杯狀細胞分泌，是高度糖基化的大分子蛋白質(zhì)[13]。其分泌數(shù)量增加及糖基化程度升高，與異常擁擠的細胞內(nèi)環(huán)境——大分子擁擠環(huán)境有關(guān)[14]。本實驗通過制備去糖基化的MUC5AC，對比分析了大分子擁擠環(huán)境對不同糖基化程度MUC5AC折疊和聚集的影響。本研究顯示，在相同濃度的同一大分子擁擠試劑中，n-MUC5AC的復(fù)性產(chǎn)率明顯低于d-MUC5AC的復(fù)性產(chǎn)率；復(fù)性過程中的聚集程度也高于后者，說明糖基化水平增高一定程度上促進了蛋白的聚集。有研究證實，過度糖基化MUC5AC的Thr2位糖鏈上甲基易與側(cè)鏈的脯氨酸殘基形成疏水鍵連接[14，15]，促使整個分子構(gòu)象呈現(xiàn)更加伸展的鏈狀結(jié)構(gòu)。這種鏈狀結(jié)構(gòu)因有利于肽鏈的進一步糖基化修飾，而成為糖基化修飾的優(yōu)勢構(gòu)象，但這卻使得MUC5AC因過多的疏水鍵和松散結(jié)構(gòu)，在大分子擁擠環(huán)境中折疊更容易形成聚集。這種異常聚集又將加劇原有的細胞內(nèi)大分子擁擠，最終形成惡性循環(huán)。

質(zhì)量濃度ρ=200 g/L的大分子擁擠試劑嚴重抑制了蛋白質(zhì)的復(fù)性過程，而ρ=100 g/L時復(fù)性產(chǎn)率明顯升高，這不僅僅是質(zhì)量濃度降低的結(jié)果。通常大分子擁擠試劑對蛋白質(zhì)復(fù)性的影響是雙重作用，一方面擁擠效應(yīng)促使新生肽鏈從松散構(gòu)象向天然蛋白的緊密構(gòu)象轉(zhuǎn)變，增加蛋白質(zhì)的折疊機會，另一方面也增強了蛋白質(zhì)的聚集趨勢引起部分折疊蛋白質(zhì)之間的相互聚集，從而降低了部分折疊蛋白轉(zhuǎn)變成為天然功能蛋白的數(shù)量。而蛋白質(zhì)的折疊和錯誤聚集之間是競爭的關(guān)系，前者可提高蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率，后者則具有相反的作用[16]。高濃度擁擠試劑存在的情況下推動蛋白質(zhì)錯誤聚集的作用占據(jù)了優(yōu)勢，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率接近于零，而低濃度的擁擠試劑存在時可同時產(chǎn)生兩種作用，正作用的效果抵消了副作用的大部分效果，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的復(fù)性產(chǎn)率提高。

不同擁擠試劑對蛋白復(fù)性過程中折疊和聚集的影響可能與各擁擠試劑本身的分子結(jié)構(gòu)及其與蛋白之間的空間排斥作用有關(guān)。PEG2000的結(jié)構(gòu)類似球形顆粒，更傾向于使蛋白形成沉淀，但不能幫助其正確折疊，因此盡管在這4種擁擠試劑中PEG2000的相對大小是最小的，但PEG2000比其余3種擁擠試劑有著更強的體積排斥效應(yīng)[17]。我們的實驗結(jié)果表明，無論是n-MUC5AC還是d-MUC5AC，在PEG2000中的復(fù)性產(chǎn)率都是最低的。BSA和Ficoll70為球狀分子，而Dextran70為無交聯(lián)結(jié)構(gòu)或具有部分交聯(lián)結(jié)構(gòu)的棒狀分子，MUC5AC在BSA和Ficoll70中復(fù)性的動力學(xué)過程與Dextran70相比，具有相似的動力學(xué)曲線，但二聚化的速率更慢，說明棒狀的Dextran70與球狀的BSA和Ficoll70相比具有更強的穩(wěn)定性[10,18]。

蛋白質(zhì)折疊是分子生物學(xué)中心法則中至今尚未解決的一個重大問題，蛋白質(zhì)折疊發(fā)生故障形成錯誤的空間結(jié)構(gòu)，不但將喪失其生物學(xué)功能，甚至?xí)鹣嚓P(guān)疾病，即蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病。其中，阿爾茲海默癥、帕金森癥、亨廷頓氏舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病和癌癥在內(nèi)的各種各樣的疾病都與蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集緊密相關(guān)[19,20]。MUC5AC不僅與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺纖維化等肺部疾病密切相關(guān)[21]，同時也與黏液性結(jié)直腸腺癌、胰腺癌以及某些眼表疾病的發(fā)病有關(guān)[21-24]。因此對MUC5AC折疊和聚集的研究，一方面可以從分子層面深入認識疾病發(fā)生發(fā)展的具體機制，探索更明確、更先進的診斷方法；另一方面通過認識導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯誤折疊的原因和途徑，發(fā)展防止蛋白質(zhì)錯誤折疊的方法，以MUC5AC作為治療靶點探索新的治療策略。有研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在某些輔助折疊分子如分子伴侶以及天然酚類化合物可避免蛋白質(zhì)異常聚集[25,26]，以保證多肽鏈在大分子擁擠環(huán)境中的正確折疊。我們今后的工作將繼續(xù)探究分子伴侶在大分子擁擠環(huán)境影響MUC5AC折疊、聚集過程中的補償效應(yīng)，為慢性氣道炎癥性疾病的有效防治提供新理論和藥物新靶點。