◆作者：歐陽海燕 沈兆艷 呂勇 吳世林

◆單位：廣州智特奇生物科技股份有限公司

目前水產(chǎn)動物病害防治主要依賴抗生素、抗寄生蟲藥及消毒劑等化學(xué)藥物，常引起細菌耐藥性、環(huán)境污染及水產(chǎn)品中藥物殘留等問題。免疫防治雖是水產(chǎn)動物疾病控制的有效途徑，但我國漁用疫苗研發(fā)及應(yīng)用相對滯后，目前只有4個水產(chǎn)動物疫苗獲國家新獸藥證書，其中僅珠江水產(chǎn)研究所研發(fā)的草魚出血病活疫苗和嗜水氣單胞菌滅活疫苗分別于2011年和2012年被批準生產(chǎn)使用，可用商品化漁用疫苗數(shù)量極其有限，遠不能滿足水產(chǎn)動物疫病防治的需求。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖中亟需安全高效、天然無殘留的飼用抗生素替代品。至今報道具有潛在應(yīng)用前景的水產(chǎn)用抗生素替代品有中草藥（Reverter等，2014）、噬菌體（Li等，2017）、卵黃免疫球蛋白（Jin 等，2013） 和植物精油（Thanigaivel等，2015）等。

植物精油又稱揮發(fā)油，廣泛存在于芳香植物中，現(xiàn)已知的植物精油超過3000種，其中約有300余種已廣泛應(yīng)用于食品、制藥和香料等行業(yè)（Bakkali等，2008）。植物精油的高效抗菌作用已被視為潛在的飼用抗生素替代品，主要研究方向集中在畜禽方面。近來研究發(fā)現(xiàn)植物精油同樣能有效防治水產(chǎn)動物細菌性疾病、水霉病和寄生蟲病，且能增強魚非特異性免疫力，提高魚類生產(chǎn)性能，并在尼羅羅非魚（Rattanchaikunsopon 等 ，2009；Rattanchaikunsopon 等 ，2010b）、蟾胡子鲇（Thomas等，2013）、金魚（Kumar等，2012）等養(yǎng)殖中取得了顯著成效。

本試驗選取廣州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油產(chǎn)品“智然香”與市場上常用的抗生素抗敵素，研究比較其對嗜水氣單胞菌、無乳鏈球菌的抑菌效果，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供參考。

1 試驗設(shè)計與方法

1.1 試驗材料

抗菌劑：廣州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油產(chǎn)品（智然香：植物精油總量≥3.5%，其中香芹酚≥2.3%，百里香酚≥1.2%），市場上購買的抗敵素。

供試菌株：嗜水氣單胞菌、無乳鏈球菌，購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 試驗儀器

恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-IG型單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-924OA電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FA2004電子天平（感量0.0001 g），上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；酒精燈、培養(yǎng)皿、試管、移液槍、接種環(huán)等。

1.3 培養(yǎng)基

無乳鏈球菌：血平板（蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，氯化鈉 5 g，脫纖維羊血50 mL，瓊脂15 g），嗜水氣單胞菌：LB瓊脂（蛋白胨10 g，牛肉膏粉 3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂15 g）溶于1000 mL水中，121℃滅菌20 min，冷卻待用。

1.4 培養(yǎng)基的處理

在超凈臺內(nèi)將滅菌后冷卻至60℃左右的培養(yǎng)基倒入滅菌好的培養(yǎng)皿，每個平皿5 mL，加入智然香、抗敵素，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基中智然香的濃度為1.7%、2%、2.3%、2.6%，抗敵素的濃度為0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、0.1%；無乳鏈球菌培養(yǎng)基智然香的濃度為 3.4%、3.7%、4%、4.3%、4.6%，抗敵素的濃度為0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%，混合均勻，冷卻凝固備用。

1.5 菌懸液的配制

從經(jīng)過活化的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期。分別吸取以上培養(yǎng)時間的供試菌液0.5 mL，加入無菌水稀釋到105～106cfu/mL，4℃保存待用。

1.6 菌液接種

每個平皿加入25μL嗜水氣單胞菌、無乳鏈球菌菌液，利用涂布棒將菌液涂布均勻，放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)并觀察菌體的生長情況，細菌生長完全被抑制時所對應(yīng)最低藥物濃度即為MIC。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌體的生長情況，無細菌生長的最低樣品濃度即為MBC值。

表1 智然香對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果

表2 抗敵素對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果

表3 智然香對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果

表4 抗敵素對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 智然香、抗敵素對嗜水氣單胞菌的抑菌效果

智然香、抗敵素對嗜水氣單胞菌的抑菌效果如表1、表2所示，“+”代表有細菌生長，“－”代表完全無細菌生長。由表1可知，智然香濃度為1.7%時有細菌生長，2%～2.6%均無細菌生長，即智然香對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度為2%；抗敵素濃度為0.6%時有細菌生長，0.7%～1%時均無細菌生長，即抗敵素對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度為0.7%。

2.2 智然香、抗敵素對無乳鏈球菌的抑菌效果

智然香、抗敵素對無乳鏈球菌的抑菌效果如表3、表4所示。由表3可知，智然香濃度為3.4%～4.3%均有細菌生長，而4.6%平皿中沒有細菌生長，即智然香對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度為4.6%。由表4可知抗敵素濃度為0.6%～0.9%均有細菌生長，濃度為1%時沒有細菌生長，抗敵素對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度為1%。

3 討論

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖病害損失比例中魚類占很大部分，主要以細菌性疾病為主，并且大多數(shù)是由嗜水氣單胞菌引起的魚類細菌性出血病。嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性，可引起多種水產(chǎn)動物的敗血癥和人類腹瀉，往往給淡水養(yǎng)殖業(yè)造成慘重的經(jīng)濟損失（儲衛(wèi)華，2001）。無乳鏈球菌又稱B簇鏈球菌，是革蘭氏陽性球菌，能引起新生兒腦膜炎、敗血癥、肺炎，以及奶牛乳腺炎，可感染多種水生動物（Wang等，2017）。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，無乳鏈球菌已對多種海、淡水魚類造成嚴重危害（劉禮輝等，2015；Barony 等，2017）。無乳鏈球菌最敏感的宿主是羅非魚，在夏、秋季易爆發(fā)，該病傳染性強，幼魚與成魚的發(fā)病率達10%～30%，死亡率25%～80%（張新艷，2008），給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。魚類爆發(fā)細菌性疾病時，由于缺乏高效疫苗，抗菌藥物仍然是養(yǎng)殖基層防控該病的首選，長期用藥和濫用藥會加快細菌對某些抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，這也給水產(chǎn)動物病害防控帶來挑戰(zhàn)，迫切需要研發(fā)新型抗生素替代品來防治水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌性疾病。

植物精油因具有廣譜抗菌性已受到科學(xué)家的熱切關(guān)注，其不僅可以有效防止飼料保存過程中青霉菌、曲霉菌等霉菌的滋生，還能調(diào)控機體內(nèi)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等有害菌的增長，目前植物精油已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物疾病防治中。Lee等（2009）發(fā)現(xiàn)，丁香精油對海魚弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的最低抑菌質(zhì)量濃度為 0.015～0.062μg/mL，但該研究未通過體內(nèi)試驗驗證。體內(nèi)試驗證實，對羅非魚腹腔注射遲緩愛德華氏菌攻毒，日糧中添加200 mg/kg香芹酚，羅非魚累積死亡率由50%降至30%；而飼喂香芹酚與對傘花烴混合精油（各為200 mg/kg）羅非魚死亡率則降至0%（Rattanchaikunsopon等，2010a）。同樣的，用添加茶樹油的飼料飼喂銀鯰魚發(fā)現(xiàn)，50μL/L的茶樹油可延長并治療感染嗜水氣單胞菌魚的壽命，治愈率達 88%（Dos Santos等，2017）。另外 Baldissera等（2017）利用茶樹油抵制嗜水氣單胞菌的研究發(fā)現(xiàn)，茶樹油可通過影響膽堿能系統(tǒng)，抑制炎癥的方式來抵制嗜水氣單胞菌的感染，同時產(chǎn)生抗氧化酶，如CAT和超氧化物歧化酶，以清除過量的自由基，減輕細菌引起的肝損傷。而植物精油對無乳鏈球菌的抑菌效果尚未有相關(guān)研究報道。

本實驗比較了植物精油產(chǎn)品“智然香”和抗敵素對嗜水氣單胞菌和無乳鏈球菌的抑菌效果，結(jié)果表明，智然香和抗敵素對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度分別為為2%和0.7%，對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度分別為4.6%和1%，表明智然香對嗜水氣單胞菌的抑菌效果好于無乳鏈球菌。雖然智然香對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度高于抗敵素，但是智然香依然可以以較小的濃度起到完全抑制嗜水氣單胞菌生長的作用，證明智然香對嗜水氣單胞菌具有良好的抗菌效果，但體外抗菌實驗只能說明所試智然香與細菌直接接觸所產(chǎn)生的影響，而對被細菌感染患病的動物的治療效果，仍需進行動物體內(nèi)實驗才能證實。

4 結(jié)論

植物精油產(chǎn)品“智然香”和抗敵素對嗜水氣單胞菌的最低抑菌濃度分別為2%和0.7%，對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度分別為4.6%和1%。植物精油產(chǎn)品“智然香”可以以較小濃度抑制嗜水氣單胞菌的生長，可用于嗜水氣單胞菌感染引起的水生動物疾病預(yù)防和控制。