嚴(yán)井學(xué) （河北省遵化市劉備寨鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站 064200）

偽狂犬病毒(PRV)，其特性為可以感染多種群體，不同種群之間也可相互傳染，致使其在發(fā)病后的影響范圍較大，極難控制。部分PRV呈現(xiàn)隱性感染的特征，雖然不會(huì)表露出明顯的染病特征，但病毒會(huì)長(zhǎng)期攜帶，很可能產(chǎn)生大范圍傳播的問題。一些歐洲國(guó)家希望通過血清學(xué)診斷的方式進(jìn)行病毒監(jiān)測(cè)，以便于達(dá)成及時(shí)根治病毒的目的，然而由于部分野生動(dòng)物也是該類病毒的攜帶者，屬于重要的傳染源，致使此類病毒的根治難度加大。現(xiàn)就其分離鑒定方法作一介紹。

1 分離鑒定方法

1.1 材料 從表現(xiàn)出偽狂犬病癥狀頻臨死亡的仔豬中提取心、肝、肺、脾等重要臟器，經(jīng)過凍融處理后，采取研磨離心的方式，得出溶液，將最上層的溶液提取后保存，并且細(xì)致標(biāo)注好溶液來(lái)源。之后根據(jù)試驗(yàn)要求，合理選擇試劑與血清，所選用的試驗(yàn)材料包括：LA Taq DNA聚合酶、DNA提取試劑盒、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PRVBarthak61疫苗株陽(yáng)性豬血清以及小白鼠；引物分別為gB up/gB down和gE up/gE down，主要作用為檢測(cè)PRV病毒[1]。

1.2 病毒的分離和純化處理 首先將經(jīng)過前期處理的研磨液過濾，得出0.22μm的溶液，之后在其中添加接種單層細(xì)胞，在37℃的環(huán)境下持續(xù)孵育1h后，將其中的接種液去除，再將濃度為2%的培養(yǎng)液加入其中，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)操作，并且查看其細(xì)胞病變狀況。當(dāng)發(fā)現(xiàn)其中有超過70%的細(xì)胞發(fā)生病變后，便可收毒，經(jīng)過凍融處理后，提取上層的清液，之后借助Vero細(xì)胞進(jìn)行再次處理。將上述操作獲得的溶液進(jìn)行DNA檢測(cè)，并且使用引物對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 鑒定方法 將分離得到的病毒進(jìn)行接種處理，將其放置于Vero細(xì)胞中持續(xù)培養(yǎng)36h，將其中的培養(yǎng)液去除，將經(jīng)過預(yù)冷處理的乙醇添加至上述所得物質(zhì)中，在其中添加被稀釋處理的HeN1株陽(yáng)性豬血清和Barthak61株陽(yáng)性豬血清，將添加量控制在1ml，將其置于37℃的空間內(nèi)孵育1h。之后借助PBS洗滌處理，并且使用顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化狀況[2]。

1.4 動(dòng)物試驗(yàn)法 將小鼠分為2組，分別進(jìn)行接種分離病毒稀釋液和PRVS株，為研究不同稀釋度對(duì)病毒狀況的影響，選用不同的稀釋度的病毒進(jìn)行注射，一般會(huì)在小鼠的腹股溝位置進(jìn)行皮下注射。第2組采取同種注射方式，接種之后，對(duì)小鼠的生長(zhǎng)狀況和臨床表現(xiàn)進(jìn)行細(xì)致記錄與分析，結(jié)合專業(yè)的算法，得出病毒的致死量。

2 結(jié)果判定

2.1 病料測(cè)定 進(jìn)行仔豬組織漿液的凍融處理后，對(duì)于其中提取的漿液進(jìn)行DNA檢定，之后使用特異性引物進(jìn)行檢測(cè)。通過對(duì)比檢測(cè)結(jié)果可知，在眾多組織漿液中，僅有腦部的組織樣品與陽(yáng)性片段相似。這就代表其中的被檢測(cè)對(duì)象中，存在腦部病毒感染的問題。整體分析所選用的研究對(duì)象所處的養(yǎng)殖場(chǎng)在進(jìn)行疫苗接種時(shí)，缺失gE基因，可以認(rèn)為其感染的病區(qū)為PRV毒株。

2.2 病毒分類 在對(duì)研磨液進(jìn)行一系列的處理后，對(duì)其中的細(xì)胞變化狀況進(jìn)行觀察，其主要變化形式為，出現(xiàn)細(xì)胞聚集表現(xiàn)后，呈現(xiàn)出變圓或者脫落的現(xiàn)像，還有部分形成合胞體。從中提取DNA后，進(jìn)行病毒檢驗(yàn)，同時(shí)借助引物對(duì)其特異性片段進(jìn)行對(duì)比分析，其片段表現(xiàn)出擴(kuò)增的現(xiàn)像，為此可以認(rèn)為其病料中存在PRV病毒感染的現(xiàn)像。

3 結(jié)論

有時(shí)候雖然養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了接種防疫，但由于病毒中的流行菌株發(fā)生了一定的轉(zhuǎn)變，致使PRV疫苗無(wú)法發(fā)揮其自身的病毒防控作用，仔豬染病現(xiàn)像難以控制，這無(wú)疑會(huì)對(duì)養(yǎng)殖事業(yè)的發(fā)展帶來(lái)較大影響。因此，要求在后續(xù)發(fā)展中，應(yīng)不斷深入研究PRV病區(qū)的流行株變化規(guī)律，形成更為有效的防疫方法，控制偽狂犬病毒的傳播與影響。