孫艷雪，關(guān)海濱，喬 穎，張紅梅，黃若暉，周志華，張 燁

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(呼和浩特 010110)

白芷傘形科植物Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。主產(chǎn)地分布于中國西南，東北，華北等地域[1]。白芷具有鎮(zhèn)痛，抗炎，美白等功效[2-4]；此外小劑量的白芷對(duì)呼吸中樞，迷走神經(jīng)等也有一定的興奮作用[5]。白芷的化學(xué)成分含有香豆素類，揮發(fā)油和微量元素等[6]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版一部通過對(duì)是否含有歐前胡素和異歐前胡素兩種成分的熒光斑點(diǎn)及歐前胡素的含量來控制白芷的質(zhì)量。中藥白芷的化學(xué)成分復(fù)雜，僅通過這兩種成分的含量來控制其質(zhì)量，難以得到真正的控制。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這兩種成分也會(huì)同時(shí)存在于川明參等藥材中，其專屬性也存在缺陷，易造成假冒偽劣問題。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。指紋圖譜[7]可綜合反映樣品化學(xué)成分種類，并根據(jù)對(duì)比其特征峰和共有峰面積進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)其質(zhì)量情況。指紋圖譜具有特征性，系統(tǒng)性和整體性等特點(diǎn)?？筛鼮槿娴?，綜合地對(duì)藥材進(jìn)行質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)?，F(xiàn)已被國際社會(huì)所認(rèn)可。本文通過對(duì)白芷指紋圖譜的研究進(jìn)行總結(jié)，為白芷藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 化學(xué)指紋圖譜

1.1 色譜指紋圖譜

1.1.1高效液相圖譜:高效液相色譜(HPLC)具有高速，高效，高靈敏度，操作自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣和柱子反復(fù)使用的特點(diǎn)。由于這些優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為指紋圖譜使用較多的方法之一，且已積累了較多經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)其成分特點(diǎn)進(jìn)行色譜條件的選擇，再結(jié)合不同的檢測(cè)器，運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)等進(jìn)行成分的數(shù)據(jù)分析?？蓪?shí)現(xiàn)白芷藥材產(chǎn)地，優(yōu)劣，真?zhèn)蔚膮^(qū)分。前人采用不同的色譜條件建立了HPLC指紋圖譜。色譜柱大都采用反相C18色譜柱，而且檢測(cè)波長多采用254 nm或320 nm，區(qū)別在于其他色譜條件的不同，導(dǎo)致其色譜峰存在一定差異。

不同產(chǎn)地的藥材因生長環(huán)境不同，其質(zhì)量可能存在一定的差異。章軍等[8]使用RP-HPLC指紋圖譜法區(qū)分不同品種的白芷藥材。以0.1%冰醋酸乙腈和0.1%冰醋酸水為流動(dòng)相，梯度洗脫，得到樣品的色譜圖同時(shí)進(jìn)行相似度的計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)確定了11個(gè)共有指紋峰且相似度都大于0.9。將其色譜峰進(jìn)行對(duì)照區(qū)分為白芷和杭白芷。吳耀華等[9]對(duì)來自不同產(chǎn)地的21批白芷樣品有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，將其分為兩組，建立HPLC指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這21批樣品中共有21個(gè)共有特征峰。兩組樣品的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD對(duì)比后無明顯差異，體現(xiàn)了指紋圖譜的一致性及穩(wěn)定性，為進(jìn)一步鑒定白芷藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。王婷婷等[10]采用相同的流動(dòng)相，不同的梯度條件，對(duì)21批次的不同產(chǎn)地的白芷進(jìn)行指紋圖譜聚類分析。檢測(cè)到21個(gè)共有峰，經(jīng)相似度系統(tǒng)分析后，相似度都小于0.9，證明藥材樣品質(zhì)量一般。張慧等[11]以甲醇和水為流動(dòng)相，建立不同產(chǎn)地的12批白芷藥材水提液的指紋圖譜，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)13個(gè)共有峰且色譜峰分離狀況良好?？捎糜诎总扑幉牡馁|(zhì)量評(píng)價(jià)。

影響白芷質(zhì)量的因素有許多，全面地分析影響白芷質(zhì)量的因素，對(duì)提高其質(zhì)量尤為重要。譚秋生等[12]建立了HPLC指紋圖譜，分別從熏硫，采收日期，生長土壤，海拔高度，產(chǎn)地，表皮類型，加工方法這些方面，探究影響渝產(chǎn)白芷質(zhì)量的主要因素。結(jié)果表明產(chǎn)地，土壤及采收加工方法對(duì)其質(zhì)量影響最大。其相似度，除熏硫樣品外，都在0.9以上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)白芷經(jīng)熏硫加工處理后，其香豆素含量明顯減少，質(zhì)量變差，這種加工方法需改進(jìn)。

白芷的加工方式多種多樣，不同加工方式對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生不同影響。席梅等[13]以甲醇和水為流動(dòng)相，梯度洗脫80 min,對(duì)來自于不同產(chǎn)地的10批的祁白芷，禹白芷，杭白芷，滇白芷樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，分別選取每個(gè)組別中的特征峰與其相對(duì)峰面積進(jìn)行對(duì)比，然后進(jìn)行相似度的系統(tǒng)檢測(cè)。結(jié)果顯示杭白芷，滇白芷部分批次為偽品，禹白芷為優(yōu)品，其余樣品質(zhì)量一般?？赡苁巧a(chǎn)環(huán)境和產(chǎn)地的不同所導(dǎo)致的結(jié)果。吳曉毅等[14]建立HPLC指紋法對(duì)市場(chǎng)上購買的來自12個(gè)藥房的白芷飲片與自然晾干和硫磺熏蒸藥材的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，而后進(jìn)行質(zhì)量一致性的評(píng)價(jià)。對(duì)12份白芷飲片樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定有12個(gè)共有峰，并且發(fā)現(xiàn)硫磺熏蒸藥材與飲片指紋圖譜差異不大，得出這10批飲片均為硫磺熏蒸藥材。9批樣品的相似度都大于0.9,說明不同地域白芷飲片的質(zhì)量特征性相同。盧曉琳等[15]研究不同加工方法的11批白芷樣品提取物HPLC指紋圖譜，其中10批未熏硫藥材，1批熏硫白芷藥材，色譜條件以水和甲醇-四氫呋喃為流動(dòng)相，梯度洗脫60 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批未熏硫白芷樣品的提取物圖譜相似度均在0.9以上，并確定了9個(gè)特征峰且對(duì)其中8個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)。對(duì)熏硫白芷樣品的提取物與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)部分出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，可能是藥品的處理方式對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響。譚秋生等[16]選取不同產(chǎn)地的白芷樣品研究加工方式對(duì)其質(zhì)量的影響，建立HPLC指紋圖譜。其除沙方式有水洗和刷除，而后對(duì)其進(jìn)行切片或切塊。結(jié)果顯示各組別的相似度都在0.9以上，其中水洗+切塊組的相似度最大。但水洗又造成歐前胡素含量損失，因此白芷不宜水洗和切片。白芷采后曬干工藝是傳統(tǒng)的商品處理方法。近幾十年來，一些中藥肉質(zhì)根或根莖的自然干燥過程已被硫磺熏蒸所取代，以縮短干燥時(shí)間和防治害蟲。盧曉琳等[17]對(duì)熏硫加工前后白芷圖譜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)白芷經(jīng)硫熏后的色譜峰面積較未熏硫的普遍減小，可以作為是否熏硫的依據(jù)。而且白芷熏硫后易造成香豆素類成分含量降低，導(dǎo)致質(zhì)量變差。認(rèn)為硫磺熏蒸法是一種不可接受的中藥加工方法。因此人們一直希望可以找到可以代替硫熏保存藥材的方法。

1.1.2 超高效液相色譜和高分離度快速液相色譜:超高效液相色譜(UPLC)和高分離度快速液相色譜(RRLC)相關(guān)的白芷指紋圖譜也有相關(guān)的報(bào)道。這兩種色譜較HPLC技術(shù)而言有更高的柱效，不僅提高了分析效率和靈敏度，同時(shí)也可對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，使中藥的研究有了更有效簡(jiǎn)便的方法。目前對(duì)于中藥白芷的研究主要集中于香豆素類和揮發(fā)油，對(duì)黃酮類知之甚少。張靜等[18]結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和RRLC建立了27批白芷藥材的指紋圖譜，探究藥材在硫熏前后的質(zhì)量，最終確定了23個(gè)共有峰。根據(jù)相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，熏硫前樣本相似度都大于0.9，而進(jìn)行熏硫后其相似度則為0.7～0.9。系統(tǒng)聚類分析和主成分分析可鑒別出白芷是否為熏硫樣品；相似度評(píng)價(jià)可區(qū)分白芷產(chǎn)地和質(zhì)量的優(yōu)劣。

1.1.3 中成藥指紋圖譜:此外，含有白芷成分的一些中成藥的指紋圖譜也有相關(guān)的研究。江潔怡等[19]對(duì)一家藥廠十批次白芷配方顆粒進(jìn)行HPLC指紋圖譜探究，確立了19個(gè)共有峰為特征峰，并進(jìn)行了指認(rèn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8批樣品相似度均大于0.9，而另外兩批只有0.6，這兩批樣品色譜峰的豐度與其他樣品也存在差異?？赡苁琴A存時(shí)間過長導(dǎo)致成分分解所致。

1.1.4 色譜聯(lián)用技術(shù):液相色譜聯(lián)用技術(shù)在白芷指紋圖譜領(lǐng)域也有較多涉及。張超云等[20]采用HPLC和GC聯(lián)用技術(shù)對(duì)11批次的白芷樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPLC圖譜中各批次藥材圖譜差異小且相似度較高，但GC圖譜中表明各批次成分含量存在一定差異，可能是揮發(fā)性成分損失導(dǎo)致的結(jié)果。兩種色譜手段聯(lián)用，系統(tǒng)地控制了白芷的質(zhì)量，方法綜合可靠。梁璐[21]建立HPLC-TLC聯(lián)用法對(duì)10批白芷飲片的真?zhèn)?，?yōu)劣進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLC有特征斑點(diǎn)且顯色清晰,HPLC確定了10個(gè)共有峰，其相似度均在0.8以上,質(zhì)量一般，但具有較好的相關(guān)性。兩者的聯(lián)用不僅可更加直觀辨認(rèn)其化學(xué)組成，對(duì)其質(zhì)量控制也有了良好的補(bǔ)充。此外，采用HPLC-DAD-ESI-MSn技術(shù)共鑒定或初步鑒定了20種呋喃香豆素，以及發(fā)現(xiàn)電噴霧離子阱質(zhì)譜儀中的破碎規(guī)律。

1.1.5 氣相色譜指紋圖譜:氣相色譜法是一種高效能，高選擇性，高靈敏度，操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛的分離分析方法。應(yīng)用于白芷的化學(xué)組成更加直觀易辨，是對(duì)HPLC的良好補(bǔ)充。王婷婷等[22]對(duì)白芷揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜進(jìn)行了分析，并對(duì)色素條件進(jìn)行考察。最終選定SE-30毛細(xì)血管色譜柱，程序升溫模式，對(duì)21批白芷藥材進(jìn)行聚類分析，分為四類，其中Ⅰ類，Ⅱ類為優(yōu)質(zhì)藥材。

1.2 紅外光譜指紋圖譜 紅外光譜有測(cè)定快，特征性強(qiáng)，無損檢測(cè)，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。而且其分辨率高，由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，各成分含量不同，這一特點(diǎn)可進(jìn)行多個(gè)組分定性定量分析，可用于藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。韓嘉欣等[23]采用傅里葉變換紅外光譜法結(jié)合共有峰率和變異峰率對(duì)不同品質(zhì)的來自三個(gè)產(chǎn)地的24批白芷親緣關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果相似度均大于0.9，但川白芷和祁白芷較高，而毫白芷相似度較低。主成分分析和系統(tǒng)聚類分析可區(qū)分白芷產(chǎn)地。不同品質(zhì)的白芷共有峰度，變異峰度相差較大，說明不同產(chǎn)地白芷成分存在差異。毫白芷質(zhì)量最低，且與其他存在明顯差距，可能經(jīng)過熏硫處理所致。吳曉毅等[24]采用傳統(tǒng)方法-HPLC指紋圖譜-近紅外光譜技術(shù)，并結(jié)合OPUS/INDENT定性分析軟件對(duì)白芷進(jìn)行聚類分析。研究表明湖北，江西飲片較優(yōu)，質(zhì)量較好，同時(shí)證明傳統(tǒng)方式與現(xiàn)代分析方法分析結(jié)果相同。

2 分子生物學(xué)指紋圖譜

分子生物學(xué)指紋圖譜是在分子水平上運(yùn)用基因序列分析方法對(duì)中藥進(jìn)行分析研發(fā)。郭丁丁等[25]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)白芷新鮮葉片進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示ISSR指紋圖譜對(duì)白芷樣品遺傳變異分析奠定了基礎(chǔ)。陳要臻等[26]建立不同產(chǎn)地白芷新鮮葉片的AFLP反應(yīng)體系，選擇不同引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，最終篩選出7種引物，并構(gòu)建了AFLP指紋圖譜。這種技術(shù)為白芷鑒識(shí)和不同品種間多樣性提供了標(biāo)準(zhǔn)化程序。

3 譜效關(guān)系

白芷有活血化瘀方面的作用，張慧等[27]把指紋圖譜與這種活性結(jié)合后進(jìn)行探索，建立了白芷提取物的HPLC指紋圖譜，應(yīng)用多元回歸和灰色關(guān)聯(lián)度相結(jié)合的方法，最終得出4、9、11、12、16號(hào)峰為活血化瘀相關(guān)峰。該研究表明基于指紋效應(yīng)關(guān)系模型的定量策略可運(yùn)用于中藥的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

4 總 結(jié)

由于傳統(tǒng)方法的局限性，對(duì)于中藥材這種化學(xué)成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物來說，有必要解決成分分離與鑒識(shí)這兩個(gè)問題，而采用單一分離模式也解決不了，也可能會(huì)導(dǎo)致大量信息的丟失。中藥指紋圖譜根據(jù)其整體性，綜合性，關(guān)聯(lián)性和層次性等特點(diǎn)可用于鑒別藥材真?zhèn)?，考察藥材?yōu)劣，區(qū)分藥材不同部位，檢測(cè)原料與成品之間的一致性和穩(wěn)定性。本文根據(jù)指紋圖譜技術(shù)的分類，綜述了白芷藥材及其中成藥的指紋圖譜的研究進(jìn)展，為白芷的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考依據(jù)。

近年來，色譜指紋圖譜被廣泛地應(yīng)用，且其發(fā)展速度較快。查閱大量文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)白芷的質(zhì)量控制多采用高效液相(HPLC)指紋圖譜。其他類型的指紋圖譜也在應(yīng)用，僅適用范圍不同。例如分子生物指紋圖譜多將色譜分離與分子生物學(xué)聯(lián)系起來，對(duì)白芷品種進(jìn)行鑒別研究，并建立其DNA指紋圖譜。隨著藥材商品的多樣化，中藥白芷假冒、偽、劣的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。因此大量文獻(xiàn)都旨在控制白芷的質(zhì)量。高效液相(HPLC)指紋圖譜因其高速，高效，高靈敏度，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成為白芷指紋圖譜的首選方法，且已經(jīng)積累的大量經(jīng)驗(yàn)。不僅可以單獨(dú)使用，也可以與二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，質(zhì)譜(MS)，氣相色譜(GC)等聯(lián)合應(yīng)用，體現(xiàn)出不可逾越的優(yōu)越性，同時(shí)使白芷的質(zhì)量得到更好的檢測(cè)。

隨著對(duì)白芷指紋圖譜不斷深入地研究，指紋圖譜與藥效之間形成的譜-效關(guān)系日益得到關(guān)注。中藥指紋圖譜仍處于發(fā)展階段，需達(dá)到功能圖譜階段，即譜-效關(guān)系。將指紋圖譜與生物活性等相關(guān)的化學(xué)成分聯(lián)系起來建立相應(yīng)的綜合數(shù)據(jù)庫。當(dāng)前，白芷譜-效關(guān)系還處于初始階段，“譜”多集中于液相色譜指紋圖譜，完整的譜還不能標(biāo)示完整的“效”，無法實(shí)現(xiàn)其一致性。因此，深入研究白芷的譜-效關(guān)系，綜合運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，全面地控制白芷質(zhì)量，進(jìn)一步完善其鑒別和質(zhì)量控制系統(tǒng)尤為重要。