張德志 劉猛 朱少功 梅家轉(zhuǎn) 季節(jié)

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。美國(guó)2000～2003年發(fā)病率增加22%[2]，上個(gè)世紀(jì)我國(guó)仍屬于結(jié)直腸癌發(fā)病率較低的國(guó)家，但隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡也呈年輕化的趨勢(shì)[3]。結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療仍面臨很大的挑戰(zhàn)[4]。目前，手術(shù)和化療是結(jié)直腸癌治療的主要手段，IDEA研究表明低危的Ⅲ期結(jié)直腸癌患者使用3個(gè)月的卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑輔助化療方案可明顯獲益[5]。相關(guān)研究也已證實(shí)氟尿嘧啶為主的輔助化療方案可顯著降低結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[6]。然而，尚有很多影響該方案療效的因素需要進(jìn)一步探索。

近年腫瘤的免疫治療已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)話(huà)題之一，程序性死亡因子1（programmed cell death 1，PD-1）及其配體程序性死亡蛋白配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1，也稱(chēng)為B7-H1或 CD274）具有抑制免疫細(xì)胞的功能，兩者廣泛表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞[7]。多種PD-1抑制劑，如派姆單抗、尼沃單抗正在被評(píng)估是否可以為消化道腫瘤患者帶來(lái)臨床獲益。PD-L1作為近年來(lái)研究最熱門(mén)的基因，成為目前免疫治療藥物重要的生物標(biāo)志物之一[8]。PD-1和PD-L1的結(jié)合可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞衰竭及發(fā)生免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。

目前研究發(fā)現(xiàn)PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[10]。且有研究表明，相對(duì)于癌旁正常組織，PD-L1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，而且相較于高分化狀態(tài)和分期較早的腫瘤細(xì)胞，低分化和分期較晚的腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平顯著增高，提示PD-L1的表達(dá)可能與結(jié)直腸癌進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[11]。隨著免疫治療藥物在我國(guó)上市，免疫治療的療效逐漸被公認(rèn)。此外，PD-L1的表達(dá)目前已經(jīng)明確基本可以作為免疫治療藥物的療效預(yù)測(cè)因子。然而，PD-L1表達(dá)和術(shù)后接受氟尿嘧啶用藥方案為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者的預(yù)后關(guān)系尚不清楚。因此，本研究旨在探討PD-L1表達(dá)對(duì)接受氟尿嘧啶用藥方案為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響，為結(jié)直腸癌的早期診斷、免疫治療及預(yù)后評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料本研究回顧性分析2012年1月～2018年12月在我院普外科接受手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌患者。本研究入組患者年齡18～80歲，中位年齡49歲。男48例（53.93%），女41例（46.07%）。ECOG評(píng)分中0分患者69例（77.53%）。結(jié)腸癌和直腸癌分別45例和44例。腫瘤分化方面，分化較好、分化中等、分化較差患者分別為10例、69例和8例。腫瘤分期方面，其中Ⅱ期患者25例，Ⅲ期患者64例。接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療患者27例，接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療患者62例。見(jiàn)表1。2015年以前患者以接受5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療，術(shù)后3～4周，第1天靜脈滴注奧沙利鉑85mg/m2超過(guò)2h，靜脈滴注亞葉酸鈣400mg/m2超過(guò)2h，靜脈推注氟尿嘧啶400mg/m2，然后每天1 200mg/m2，共計(jì)兩天持續(xù)靜脈滴注，每2周為1個(gè)周期。2015年以后患者以接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療，術(shù)后3～4周，口服卡培他濱，1000mg/m2，第1～14天2次/d，每21天為1個(gè)周期。奧沙利鉑，80～130mg/m2，靜脈滴注，第1天。輔助化療結(jié)合患者情況給予6～8個(gè)周期治療。本研究最后一次隨訪時(shí)間為2018年6月，所有患者從納入研究到最后一次隨訪的中位隨訪時(shí)間為5.45年（0.60～7.50 年）。

表1 腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)情況[n（%）]

入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80歲，ECOG評(píng)分0～2分者；②既往未接受過(guò)系統(tǒng)性治療者；③主要器官功能在治療前7天內(nèi)符合標(biāo)準(zhǔn)者；④經(jīng)病理確診為結(jié)直腸癌患者；⑤預(yù)期生存期至少3個(gè)月者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的患者；②遺傳性結(jié)直腸癌綜合征患者。本研究得到我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在治療過(guò)程中依據(jù)NCI毒性分級(jí)進(jìn)行相應(yīng)的劑量調(diào)整，若出現(xiàn)Ⅳ級(jí)腎損害、神經(jīng)毒性、心臟毒性、肝毒性等危及生命的不良反應(yīng)，立即終止治療。

1.2 免疫組織化學(xué)（ICH）法采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行檢測(cè)，按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，其中抗PD-L1（1∶100）4℃孵育過(guò)夜。鼠抗人PD-L1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組化SP-9000試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。PD-L1的表達(dá)采用二級(jí)計(jì)分法，染色強(qiáng)度按顏色由淺入深依次為：0分（陰性），1分（弱陽(yáng)性），2分（中度陽(yáng)性），3分（強(qiáng)陽(yáng)性）；按陽(yáng)性細(xì)胞占計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的百分比評(píng)分：1分（0～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。兩者計(jì)分相乘，低表達(dá)組為0～4分，高表達(dá)組為6～12分[12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制Kaplan-Meier曲線比較PD-L1低表達(dá)組和高表達(dá)組OS的差異。計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總生存期（OS）的計(jì)算為從開(kāi)始做手術(shù)的時(shí)間到患者因?yàn)楦鞣N原因出現(xiàn)死亡的日期或最后一次隨訪結(jié)束的日期。采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型對(duì)OS構(gòu)建多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

影響OS的風(fēng)險(xiǎn)因素如年齡、性別、ECOG評(píng)分、病理分期以及PD-L1表達(dá)納入該模型。Cox模型當(dāng)中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量為ECOG評(píng)分（OR=2.85，P=0.006）、腫瘤分期（OR=3.11，P＜0.001）和PD-L1表達(dá)（OR=1.77，P=0.010），見(jiàn)表2。

圖1 不同PD-L1表達(dá)水平的總生存期曲線對(duì)比

表2 對(duì)OS構(gòu)建校正其他變量的多變量Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型

3 討論

2.1 PD-L1在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況結(jié)直腸癌組織中PD-L1的表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)。

2.2 PD-L1表達(dá)對(duì)接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響在總生存期（OS）方面，PD-L1高表達(dá)組和低表達(dá)組的中位總生存期（mOS）分別為3.90年和5.80年，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.032），見(jiàn)圖1。為了進(jìn)一步校正其他混雜因素的影響，本研究構(gòu)建了Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型，將可能

本研究共納入89例術(shù)后接受氟尿嘧啶用藥方案為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中PD-L1的表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)，PD-L1低表達(dá)組的生存時(shí)間高于PD-L1高表達(dá)組，提示PD-L1高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者傾向于較差的預(yù)后。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型也證實(shí)了PD-L1是影響臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。研究結(jié)果與李海青等[12]對(duì)PD-L1在結(jié)直腸癌的表達(dá)及預(yù)后研究分析結(jié)果具有一致性。結(jié)合以上內(nèi)容可推斷PD-L1可能參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸過(guò)程，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，在一定程度上解釋了PD-L1高表達(dá)會(huì)影響結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。

多項(xiàng)研究表明PD-L1在結(jié)直腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，但一項(xiàng)納入454例CRC受試者的研究報(bào)道了只有12%的患者表達(dá)了PD-L1[13]，可能與腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)。有學(xué)者對(duì)具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和突變狀態(tài)的結(jié)直腸癌進(jìn)行PD-L1免疫組織化學(xué)檢測(cè)，并將PD-L1的表達(dá)與臨床預(yù)后相關(guān)聯(lián)，研究結(jié)果表明PD-L1陽(yáng)性不能作為生存率預(yù)測(cè)的指標(biāo)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性較高的患者與較低的生存率有相關(guān)性，研究結(jié)果解釋了PD-1或PD-L1抑制劑對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌患者的作用機(jī)制，并提出PD-L1可能會(huì)作為結(jié)直腸癌患者的潛在預(yù)測(cè)及預(yù)后指標(biāo)之一[14]。以上研究提示了PD-L1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后關(guān)系尚不清楚。本研究探索了術(shù)后接受氟尿嘧啶用藥方案為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者PD-L1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，但缺少了進(jìn)一步深入探討PD-L1在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性之間的關(guān)系，在后期研究中可做深入探索。

本研究結(jié)果表明腫瘤發(fā)病部位可能與PD-L1的表達(dá)具有相關(guān)性，與李甜甜[15]研究結(jié)果一致，結(jié)腸和直腸由于胚胎生長(zhǎng)來(lái)源的不同周?chē)馨徒Y(jié)數(shù)目也不同，結(jié)腸淋巴結(jié)數(shù)目要多于直腸，因此PD-L1表達(dá)在不同發(fā)病部位具有差異性。Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型中影響總生存OS的因素除了PD-L1表達(dá)外，還有ECOG評(píng)分和腫瘤分期，通常ECOG評(píng)分越高，患者預(yù)后越差，Ⅲ期患者的OS生存時(shí)間要低于Ⅱ期患者。本研究中27例患者氟尿嘧啶用藥方案以5-氟尿嘧啶為主，62例患者氟尿嘧啶用藥方案以卡培他濱為主，有報(bào)道5-氟尿嘧啶與卡培他濱兩種給藥方式存在差異，兩者療效無(wú)差異[16]。有報(bào)道在晚期結(jié)直腸癌研究中，奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類(lèi)藥物時(shí)，患者可選擇使用5-氟尿嘧啶或卡培他濱或替吉奧膠囊[17]。

綜上所述，術(shù)后接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)明顯高于正常組織，PD-L1高表達(dá)患者生存時(shí)間短，并提示PD-L1可能會(huì)成為術(shù)后接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。此項(xiàng)研究屬于回顧性研究，觀察的樣本量有限，檢測(cè)方法單一，存在一定的局限性，但本研究為后續(xù)關(guān)于PD-L1的表達(dá)對(duì)術(shù)后接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)輔助化療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響的相關(guān)研究提供了一定的參考價(jià)值。