焦勝雙,許士文,陳 玉,韓 瀟,趙大慶,張翌楠*,喬魯芹*

1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,山東 泰安271018

2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院,北京102442

3.泰山風景名勝區(qū)管理委員會,山東 泰安271018

4.泰安市新泰市林業(yè)局,山東 新泰271200

光肩星天牛Anoplophora glabripennis是河西走廊重要造林樹種二白楊Populus gansuensis的主要害蟲之一[1]，其幼蟲危害樹干的韌皮部和木質(zhì)部。有研究表明，植食性昆蟲和寄主植物之間普遍流通的化學信息素在兩者相互關系中起到至關重要的作用，一方面，昆蟲根據(jù)植物揮發(fā)物定位寄主植物；另一方面，植物自身釋放的植物信息素對植食性昆蟲具有驅(qū)避作用，同時植物受到昆蟲危害時會釋放化學信息素，吸引昆蟲天敵[2,3]，光肩星天牛和二白楊之間同樣存在這樣的化學通訊。

近年來有關楊樹揮發(fā)物的測定已有報道，朱敬芳等[4]采用水蒸氣蒸餾法提取楊樹葉揮發(fā)性物質(zhì)，并結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜（Gas chromatography-mass spectrometery,GC-MS）分析其化合物28 種，其中近半數(shù)為烷烴類；唐進根等[4]利用固相微萃?。⊿olid phase micro extraction,SPME）和GC-MS 分析黑楊Populus nigra樹葉中的揮發(fā)性物質(zhì)20 種；諸葛飄飄[6]利用Tenax 吸附法結(jié)合GC-MS 測定了楊樹整株的揮發(fā)物。目前關于楊樹揮發(fā)物的研究大多取材于健康的葉片和全株，而對于受到天牛幼蟲危害的楊樹樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的研究鮮見報道。以往關于揮發(fā)性物質(zhì)的研究大多采用單一的吸附方法進行前期氣味物質(zhì)收集，且未做方法間比較；另外在分析技術(shù)上主要采用GC-MS，該法存在靈敏度低，難以準確定性等問題。因此，建立準確、高效分析二白楊受害樹皮揮發(fā)性物質(zhì)的前處理方法和檢測分析方法具有重要意義。

為進一步研究二白楊樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)，本研究采用四種吸附方式（活性炭吸附法、Tenax 吸附法、固相微萃取法和頂空進樣法）吸附二白楊受光肩星天牛危害的樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)，再結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Gas chromatography-tandem mass spectrometery,GC-MS/MS）進行定性分析，初步確定二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)，并以此來比較四種吸附方法的優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮二白楊受光肩星天牛危害樹皮，2018 年6 月采集于甘肅省嘉峪關市文殊村。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(GCMS-TQ8030，日本島津公司)；全自動頂空進樣器（HS-20，日本島津公司）；固相微萃取頭（100μm PDMS，美國SUPELCO 公司）；活性炭吸附管（6×120 mm，20-40目，鹽城尊科電子儀器有限公司）；Tenax TA 吸附管（6×150 mm，150 mg，鹽城尊科電子儀器有限公司）；空氣泵（SGK-2LB，北京東方精華苑科技有限公司）；正己烷（色譜純，天津市凱通化學試劑有限公司）。

1.3 揮發(fā)性物質(zhì)的吸附

用于試驗的受光肩星天牛危害的二白楊新鮮樹皮，采自同一株樹木，均為光肩星天牛的排糞口附近的樹皮，去掉粘連的木屑和蟲糞，置于密封袋于-40 ℃保存。

1.3.1 活性炭管吸附和Tenax 管吸附 稱取50 g 的二白楊受害樹皮，剪成約1 cm2小塊狀，置于250 mL抽濾瓶中，將活化好的吸附管通過導管連接在抽壓機和抽濾瓶之間，流速為100 mL/min，吸附時長約2 h（圖1）。吸附完成后，用正己烷洗脫，取洗脫液1 μL 進行GC-MS/MS 分析。兩種吸附管采樣的試驗操作步驟相同。

圖1 活性炭吸附法和Tenax 吸附法揮發(fā)性物質(zhì)吸附流程圖Fig.1 Flow chart of volatile matter adsorption by activated carbon and Tenax adsorption

1.3.2 固相微萃取法 稱取50 g 二白楊受害樹皮，剪成約1 cm2小塊狀，置于250 mL 的錐形瓶中，用濾紙將瓶口密封，在室溫下放置30 min，待燒杯內(nèi)部的樹皮揮發(fā)性物質(zhì)與頂層空氣達到動態(tài)平衡之后，將固相微萃取頭插入錐形瓶頂層空氣中，萃取2 h。吸附完成后，直接進行GC-MS/MS 分析。

1.3.3 頂空進樣法 稱取2.5 g 二白楊受害樹皮，剪成1 cm2小塊狀，置于頂空進樣瓶中，用瓶蓋密封，放入頂空進樣器，進行GC-MS/MS 分析。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 頂空進樣器 恒溫爐：80 ℃，樣品流路：150 ℃，傳輸線溫度：150 ℃，樣品瓶恒溫時間：15 min，樣品瓶壓力：7 kPa，樣品瓶加壓時間：0.50 min，加壓平衡時間：0.10 min，導入時間：0.50 min，導入平衡時間：0.10 min，進樣時間：0.50 min。

1.4.2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 活性炭采樣-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、Tenax 采樣法-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和固相微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法：色譜柱型號為DB-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）毛細管柱；進樣口溫度：260 ℃；進樣方式：分流，分流比：5；進樣時間：1.00 min；載氣：氦氣；柱箱溫度：35 ℃保持1.0 min，以5 ℃/min 速率升至160 ℃，再以20 ℃/min 升至220 ℃保持15 min；離子源溫度：230 ℃，接口溫度：250 ℃，溶劑延遲時間：3.5 min，采集方式：全掃描離子采集方式（Scan），電子能量：70 eV，質(zhì)量數(shù)范圍：40 u-350 u。固相微萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，進樣方式：不分流。頂空進樣-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，色譜柱型號為Rtx-5MS（30.0 m×0.25 mm×0.25 um）毛細管柱，進樣方式：不分流。

2 結(jié)果與分析

在上述吸附條件和色譜質(zhì)譜條件下，利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定二白楊受害樹皮中的揮發(fā)性物質(zhì)，揮發(fā)性物質(zhì)種類主要為烷烴類、烯烴類、醇類、酯類、醛類、芳香烴類、酮類、酚類等（見圖3），共同的物質(zhì)有：十四烷、正二十烷、正二十一烷、正三十二烷、正五十四烷、1-十四醇、2-乙基己醇、正己醛、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、2,4-二叔丁基苯酚、磷酸三乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、甲苯、磷酸三乙酯、棕櫚酸甲酯、二十七烷醇、硬酯酸甲酯、α-蒎烯、(+)-環(huán)苜蓿烯、苯乙酮等。4種吸附方法揮發(fā)性物質(zhì)在數(shù)量上和響應值上差異性非常明顯（見圖2）。

2.1 活性炭-GC-MS/MS 測定二白楊受害樹皮中的揮發(fā)物

活性炭吸附法結(jié)合GC-MS/MS 共檢測到29 個色譜峰，二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)25 種，其中烷烴類11 種，烯烴類2 類，醇類4 種，酯類4 種，酚類2 種，胺類1 類，喹啉1 類。

2.2 Tenax-GC-MS/MS 測定二白楊受害樹皮中的揮發(fā)物

Tenax 吸附法結(jié)合GC-MS/MS 共檢測到56 個色譜峰，測定的二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)有51 種，其中烷烴類9 種、烯烴類5 種、醇類6 種、酯類14 種、醛類6 種、芳香烴類3 種、酮類2類、酚類4 種、酸類1 種、喹啉類1 種。

2.3 SPME-GC-MS/MS 測定二白楊受害樹皮中的揮發(fā)物

SPME 法結(jié)合GC-MS/MS 共檢測到48 個色譜峰，測定的二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)有36 種，其中烷烴類8 種、烯烴類1 種、醇類6 種、酯類5 種、醛類11 種、酮類2 種、酚類1 種、酸酐1 種，嗎啡類1 種。

2.4 HS-GC-MS/MS 測定二白楊受害樹皮中的揮發(fā)物

頂空進樣（Headspace sampling，HS）結(jié)合GC-MS/MS 測定的二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)共檢測到39 個色譜峰，測定的二白楊受害樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)有37 種，烯烴類20 種、醇類2 種、酯類1 種、醛類8 種、芳香烴4 種、酮類2 種。

圖2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定的揮發(fā)物的色譜圖Fig.2 Chromatogram of volatile compounds determined by gas chromatography tandem mass spectrometry

圖3 揮發(fā)物種類對比Fig.3 Comparison of volatile species

3 討論

3.1 四種揮發(fā)性物質(zhì)前處理方法對比

通過對揮發(fā)物種類和色譜響應面積等試驗結(jié)果進行綜合比較，可分析得出常溫環(huán)境下四種前處理方法具有如下特點：

活性炭吸附法經(jīng)GC-MS/MS 定性分析測定出的物質(zhì)更容易測定出烷類、醇類、酯類、酚類、烷類等種類的揮發(fā)物，但整體上揮發(fā)物種類較少，響應值也低，同其他三種采集方法相比，不適合用來吸附樹皮的揮發(fā)性物質(zhì)（見圖2）。

Tenax 吸附法采集的揮發(fā)物比較全面，采集范圍廣，吸附效果好，吸附量也更大，是四種吸附方法中檢測到物質(zhì)種類最多和最全面的一種（見圖2 和表1）。在GC-MS/MS 分析時，因色譜柱超載，Tenax 吸附法和活性炭的進樣分流比設定為5:1，SPME 法和HS 法在分流比5:1 的條件下響應值過小，所以進樣分流比設定為不分流，在這樣條件下，Tenax 吸附法的響應面積遠大于另外三種方法。Tenax 管方便攜帶且能重復利用，其填充物聚2,6-二苯基對苯醚對常溫環(huán)境下的低濃度物質(zhì)也具有良好的富集效果[7]，是我國室內(nèi)空氣質(zhì)量標準規(guī)定的總揮發(fā)性有機物吸附劑[8]。但Tenax 管在老化、吸附以及解析過程中，耗時較大。

同其他三種方式相比，SPME 法吸附更多的烷烴類、醇類、醛類物質(zhì)，其中正己醛、2-己烯醇和正己醇等醛類、醇類綠葉揮發(fā)物（Green leaf volatiles,GLVs）在SPME-GC-MS/MS 結(jié)果中大量發(fā)現(xiàn)。SPME 法耗時短，且能重復利用，但對萃取頭的材料選擇以及對萃取條件等要求較高，本文綜合以往報道[9-11]，采用了100 μm 的PDMS 纖維頭在常溫（25 ℃）環(huán)境下萃取2 h。GC-MS/MS 定性結(jié)果顯示，SPME 方法測定出的烯烴類物質(zhì)較少，與文獻的測定結(jié)果一致[5]，這可能與萃取頭的材料有關。

HS 法對烯烴類化合物具有良好的采集效果，是采集烯類物質(zhì)最合適的方法。本試驗綜合以往報道[12,13]和預試驗結(jié)果設定了HS 試驗儀器參數(shù)。GC-MS/MS 定性結(jié)果顯示，同其他三種方式相比，HS 法測定出更多類型的烯烴類物質(zhì)，如(+)-環(huán)苜蓿烯、R-(+)-檸檬烯、莰烯、丁香烯、蓽澄茄油烯、杜松烯、反-菖蒲烯等烯類物質(zhì)（見表1）。HS 法操作簡易，是耗時最短的吸附方法，但也是四種前處理方法中響應面積最小的一種。

本研究利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）對4 種吸附方法采集到的揮發(fā)性物質(zhì)進行了定性分析。相對于氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS），氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的質(zhì)譜分辨率和靈敏度更高，定性出的化合物更加可靠。

不同的吸附方法進行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用定性分析得到的結(jié)果表明，不同的吸附方法對不同物質(zhì)具有不同程度的吸附能力。活性炭不適合用于吸附二白楊受害樹皮揮發(fā)性物質(zhì)，Tenax 吸附、SPME和HS 三種前處理方法的結(jié)果相互補充，不能互相代替，因此可以針對不同的試驗需求，選擇合適的吸附方法進行揮發(fā)性物質(zhì)種類的測定。SPME 法能吸附更多種類的醇類、醛類綠葉揮發(fā)物，所以若研究對象為綠葉揮發(fā)物，SPME 法是最合適的吸附方式。根據(jù)其他學者的研究進展[14-16]，在研究光肩星天牛對二白楊何種揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生趨向性的試驗中，烯類、醛類物質(zhì)（如3-蒈烯、R-(+)-檸檬烯和壬醛等）可能在光肩星天牛取食二白楊或天敵昆蟲定位天牛過程中發(fā)揮作用，所以Tenax 吸附法和頂空進樣法這兩種采集方法更加適合。

3.2 四種揮發(fā)性物質(zhì)前處理方法結(jié)果差異原因

4 種前處理方法所得到的結(jié)果存在差異，這主要是由吸附方法自身特點造成的?；钚蕴亢蚑enax吸附管的填充材料和固相微萃取纖維頭表面涂料的固有屬性的不同，對于相同的物質(zhì)，具有不同的吸附效果。在自動進樣的過程中，加溫加壓的步驟影響二白楊樹皮中揮發(fā)物質(zhì)的揮發(fā)，進而影響定性結(jié)果，但相對其他方法，頂空進樣測得的化合物的響應值較低，這與頂空進樣瓶容量小有關，且相對于活性炭、Tenax 填充物和固相微萃取纖維頭，頂空進樣沒有對化合物的捕獲和濃縮富集能力。

4 結(jié)論

本研究基于靈敏度高，定性更加準確的GC/MS/MS 分析二白楊受害樹皮中的揮發(fā)性物質(zhì)，檢測出的物質(zhì)主要有烷烴類、烯烴類、醇類、酯類、醛類、芳香烴類、酮類、酚類等，綜合比較了活性炭吸附法、Tenax 吸附法、固相微萃取法和頂空進樣法4 種前處理方法，從結(jié)果看，Tenax 吸附-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和頂空進樣-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是測定二白楊受害樹皮揮發(fā)性物質(zhì)較適合的方法。