余昌霞，趙 妍，陳明杰，楊煥玲，奚莉萍，汪 虹，查 磊

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)中心，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海201403）

香菇［Lentinula edodes（Berk.）Pegler］隸屬于光茸菌科（Omphalotaceae）香菇屬（Lentinula），其香味濃郁、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的食用菌之一［1］。我國(guó)已有近千年的香菇栽培歷史，據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2016年中國(guó)香菇年總產(chǎn)量已達(dá)到898.30萬t。香菇‘L808’菌株因菌絲抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣，遺傳特性優(yōu)良、穩(wěn)定，子實(shí)體菌柄短、菌肉厚、菇型大、組織致密，品質(zhì)極佳，備受消費(fèi)者和生產(chǎn)者關(guān)注和喜愛，也是我國(guó)目前主要的秋栽香菇品種之一。2015年底，我國(guó)北方香菇栽培基地的農(nóng)戶從主栽香菇品種‘L808’中采摘到少量幾乎沒有香菇香味的子實(shí)體，外觀上難以與‘L808’區(qū)分，將其經(jīng)過組織分離得到新菌株，命名為ww808。香菇無香味可能會(huì)影響其商品價(jià)值，進(jìn)一步影響銷量。

風(fēng)味物質(zhì)是評(píng)價(jià)食用菌品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。食用菌的風(fēng)味包括香味和滋味［2-3］，香味主要依賴于揮發(fā)性風(fēng)味成分，通過人的嗅覺系統(tǒng)感受；滋味則取決于其含有的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)的種類及含量，通過人的味覺系統(tǒng)感受［4-6］。食用菌獨(dú)特的滋味，主要是因?yàn)楹幸恍┤缬坞x氨基酸、5’-核苷酸、可溶性糖（醇）、有機(jī)酸等小分子物質(zhì)發(fā)揮其風(fēng)味作用，表現(xiàn)出鮮、甜等滋味?；诖?，可利用氨基酸自動(dòng)分析儀、離子色譜儀、高效液相色譜儀等儀器分別對(duì)香菇子實(shí)體的非揮發(fā)性呈味物質(zhì)［游離氨基酸、可溶性糖（醇）、有機(jī)酸及5’-核苷酸］的組成及含量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算等鮮濃度值（EUC），對(duì)香菇菌株子實(shí)體的鮮味進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。筆者曾采用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)香菇菌株‘L808’與突變菌株ww808的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)‘L808’和ww808菌株菌絲體中揮發(fā)性成分主要是醛類化合物、芳香和烯烴化合物，其次是含硫化合物。ww808菌株的前兩類成分含量較高，但含硫化合物僅為‘L808’菌株的9.16%；兩菌株子實(shí)體中揮發(fā)性成分主要是含硫化合物，其中ww808菌株的含硫化合物含量是‘L808’的64.61%［7］。在此基礎(chǔ)上，本研究擬進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)香菇菌株子實(shí)體的滋味進(jìn)行分析，以期闡明香菇‘L808’菌株與其突變菌株ww808的風(fēng)味差異，分析源自‘L808’的突變菌株ww808究竟有哪些代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基質(zhì)

香菇菌株‘L808’保藏于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，ww808菌株（‘L808’突變菌株，幾乎無香菇香味）受贈(zèng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所張金霞研究員。

菌絲培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，栽培試驗(yàn)的配方為78%木屑、20%麩皮、2%石膏粉，含水量60%。

1.2 主要儀器與試劑

中藥粉碎機(jī)（DJ-10A型），上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A型），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凱氏定氮儀（VELP UDK169型），意大利VELP公司；高效液相色譜儀（HPLC，Waters 2695型），美國(guó)沃特世公司；Ultimate AQ-C18液相色譜柱，月旭科技（上海）股份有限公司；離子色譜儀（Dionex ICS-2500型）、脈沖安培檢測(cè)器、陰離子交換柱CarboPac MA1，美國(guó)戴安公司；氨基酸自動(dòng)分析儀（Hitachi L-8900型），日本日立公司。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉伯糖醇、甘露醇、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、赤蘚糖醇、果糖、半乳糖和巖藻糖等9種可溶性糖及糖醇標(biāo)準(zhǔn)品，延胡索酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸和抗壞血酸等7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，5’-AMP（5’-腺苷酸）、5’-CMP（5’-胞苷酸）、5’-GMP（5’-鳥苷酸）、5’-IMP（5’-肌苷酸）、5’-UMP（5’-尿苷酸）、5’-XMP（5’-黃苷酸）等單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。

1.3 樣品處理

香菇栽培時(shí)間為2016年11月中旬，采收第一潮菇作為樣本，將采收的子實(shí)體放于50°C烘箱內(nèi)烘干24—48 h，使其含水量低于10%，迅速用粉碎機(jī)粉碎，過60目（250μm孔徑）篩后置于干燥器中備用。

1.4 粗蛋白測(cè)定

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量［8］。

1.5 水解氨基酸測(cè)定及評(píng)價(jià)

參照張璐等［9］的方法進(jìn)行水解氨基酸的提取，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定各種氨基酸的含量［10-11］，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。氨基酸評(píng)分（Amino acid score，AAS）計(jì)算參照WHO/FAO的方法［12］，化學(xué)評(píng)分（Chemical score，CS）計(jì)算參照FAO和Seligson等［13］推薦的方法，必需氨基酸指數(shù)（Essential amino acid index，EAAI）評(píng)價(jià)參照 Oser等［14-15］的方法，氨基酸比值系數(shù)（Ratio coefficient of amino acid，RC）以及氨基酸比值系數(shù)分（Score of RC，SRC）參照朱圣陶等［16］的方法計(jì)算。

1.6 可溶性糖（醇）測(cè)定

樣品提取參照薛俊杰等［17］的方法進(jìn)行，采用ICS-2500型離子色譜儀參照周帥等［18］構(gòu)建的高效陰離子色譜法檢測(cè)可溶性糖（醇）含量，每樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.7 有機(jī)酸測(cè)定

參照谷鎮(zhèn)等［19］的方法提取有機(jī)酸，采用Waters 2695型高效液相色譜儀參照陳萬超等的方法［20］檢測(cè)有機(jī)酸含量，每樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.8 游離氨基酸測(cè)定

參考Tseng等［21］和Tsai等［22］的方法并適當(dāng)改進(jìn)對(duì)游離氨基酸進(jìn)行提取，采用L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定游離氨基酸含量，每樣品做3次平行試驗(yàn)。

1.9 呈味核苷酸測(cè)定

參照Taylor等［23］的方法提取核苷酸，采用Waters 2695型高效液相色譜儀參照文獻(xiàn)［24-25］測(cè)定核苷酸含量，每處理做3次平行試驗(yàn)。

1.10 等鮮濃度值（Equivalent um am i concentration，EUC）計(jì)算

鮮味氨基酸與呈味核苷酸的協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度，既可以顯著提高鮮味效果，也具有協(xié)同和增鮮效果。等鮮濃度值的計(jì)算公式［26］為：Y＝∑ai bi＋1 218（∑ai bi）（∑aj bj），式中：Y為等鮮濃度［g MSG/（100 g）］；ai為鮮味氨基酸（谷氨酸或天冬氨酸）含量［g/（100 g）］；aj為呈鮮核苷酸（5’-GMP、5’-IMP、5’-XMP、5’-AMP）含量［g/（100 g）］；bi為鮮味氨基酸相對(duì)谷氨酸比值（谷氨酸 ＝1、天冬氨酸 ＝0.077）；bj為呈鮮核苷酸相對(duì) 5’-肌苷酸比值（5’-GMP＝2.3、5’-IMP＝1、5’-XMP＝0.61、5’-AMP＝0.18）；1 218為協(xié)同作用常數(shù)。

1.11 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

2個(gè)香菇菌株‘L808’和ww808子實(shí)體中的粗蛋白含量分別為（23.29±0.04）g/（100 g）和（27.21±0.28）g/（100 g），ww808菌株的粗蛋白含量約為‘L808’菌株的1.17倍。2個(gè)香菇菌株均含有17種常見氨基酸（色氨酸未檢測(cè)），ww808菌株的水解氨基酸總量及必需氨基酸總量均高于‘L808’菌株（表1），分別為‘L808’菌株的1.22和1.13倍。‘L808’和ww808菌株的必需氨基酸（EAA）與總氨基酸（TAA）比值E/T分別為0.34和0.31，必需氨基酸（EAA）與非必需氨基酸（NEAA）的比值E/N分別為0.52和0.46。FAO/WHO提出的理想蛋白模式為E/T達(dá)到0.4和E/N在0.6以上［9-10］，表明2個(gè)香菇菌株中的氨基酸均接近FAO/WHO提出的理想蛋白模式，屬于質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)。

表1 2個(gè)香菇菌株水解氨基酸含量Table 1 Hydrolytic am ino acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 g·（100 g）-1干重

如表2所示，‘L808’和ww808菌株的必需氨基酸總含量分別為412.94 mg/g pro和393.99 mg/g pro，均明顯優(yōu)于WHO/FAO模式（350 mg/g pro），但低于雞蛋模式（497 mg/g pro），且‘L808’菌株蛋白質(zhì)量?jī)?yōu)于ww808菌株。從單個(gè)氨基酸來看，‘L808’菌株除Met＋Cys之外，其他必需氨基酸含量均高于WHO/FAO模式值，而ww808菌株除Lys和Leu外，其他氨基酸含量也均高于WHO/FAO模式值?；贏AS計(jì)算的‘L808’和ww808菌株的第一限制氨基酸分別是Met＋Cys和Lys，除此之外，其他必需氨基酸含量均高于標(biāo)準(zhǔn)模式蛋白。根據(jù)CS計(jì)算的‘L808’和ww808菌株的第一限制氨基酸分別是Met＋Cys和Ile，‘L808’菌株中除Met＋Cys化學(xué)評(píng)分低于ww808菌株外，其他氨基酸化學(xué)評(píng)分均高于ww808菌株，比ww808菌株更接近雞蛋蛋白。氨基酸平衡性分析表明，‘L808’和ww808菌株的氨基酸比值系數(shù)分別為0.89—1.18和0.88—1.19，‘L808’菌株的Thr和Met＋Cys以及ww808菌株的Met＋Cys和Lys分別正負(fù)向偏離平衡譜最遠(yuǎn)，經(jīng)計(jì)算兩個(gè)香菇菌株的氨基酸比值系數(shù)分SRC分別為88.98和87.69，均高于部分糧食作物小麥（72.47）、大米（70.50）以及卵清蛋白（81.22）。‘L808’和ww808菌株的EAAI分別為78.57和76.19，說明‘L808’菌株蛋白中必需氨基酸均衡性、相互之間比例均優(yōu)于ww808菌株。

表2 2個(gè)香菇菌株蛋白的必需氨基酸營(yíng)養(yǎng)特征分析Table 2 Essential am ino acid nutritional characteristics analysis of protein of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808

2.2 呈味物質(zhì)分析與鮮味評(píng)價(jià)

2.2.1 可溶性糖（醇）含量

2個(gè)香菇菌株中主要檢測(cè)到3種糖（醇），其他種類的糖（醇）含量相對(duì)太低，可忽略不計(jì)。如表3所示，含量最高的是甘露醇，其次是阿拉伯糖醇，海藻糖含量最低。‘L808’菌株的可溶性糖（醇）總量較ww808菌株高，且阿拉伯糖醇和海藻糖含量均高于ww808菌株，甘露醇含量在2個(gè)菌株中差異不大。

表3 2個(gè)香菇菌株的可溶性糖（醇）含量Table 3 Soluble sugar（alcohol）content of Lentinula edodes‘L808’and ww808 mg·g-1

2.2.2 有機(jī)酸含量

如表4所示，2個(gè)香菇菌株中共檢測(cè)到5種有機(jī)酸，其中琥珀酸含量最高，其次是蘋果酸。‘L808’和ww808菌株的有機(jī)酸種類相同，但無論是單個(gè)有機(jī)酸含量還是有機(jī)酸總量，ww808菌株均高于‘L808’菌株。其中，ww808菌株的有機(jī)酸總量、琥珀酸、蘋果酸含量分別是‘L808’菌株的2.49倍、3.07倍和2.18倍。

表4 2個(gè)香菇菌株的有機(jī)酸含量Table 4 Organic acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1

2.2.3 游離氨基酸差異分析

如表5所示，‘L808’菌株的游離氨基酸含量稍低于ww808菌株。2個(gè)香菇菌株中谷氨酸含量均為最高，它是主要的呈鮮氨基酸種類，‘L808’和ww808菌株的谷氨酸含量分別占鮮味氨基酸總量的94.51%和89.02%。‘L808’菌株鮮味氨基酸含量略高于ww808菌株，2個(gè)香菇菌株中鮮味氨基酸含量均處于低水平（鮮味氨基酸含量＜5 mg/g）［27］?！甃808’和ww808菌株的甜味氨基酸在3種滋味氨基酸中含量最高，其中丙氨酸含量?jī)H次于谷氨酸，也是主要的甜味氨基酸，其與鮮味物質(zhì)相互作用可達(dá)到提鮮的效果。

表5 2個(gè)香菇菌株的游離氨基酸含量Table 5 Free am ino acids content of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1干重

2.2.4 5’-核苷酸分析及鮮味評(píng)價(jià)

2個(gè)香菇菌株中均檢測(cè)出5種單核苷酸，未檢測(cè)到5’-XMP，‘L808’菌株的單核苷酸、鮮味核苷酸及總核苷酸含量均低于ww808菌株（表6）。其中，5’-胞苷酸含量最高，在2個(gè)香菇菌株中相差也最大。2個(gè)香菇菌株中鮮味核苷酸含量均處于低水平（鮮味核苷酸含量＜1 mg/g）［27］。

表6 2個(gè)香菇菌株5’-核苷酸含量及EUC評(píng)價(jià)Table 6 The content of 5’-nucleotides and EUC value of Lentinula edodes strains‘L808’and ww808 mg·g-1

鮮味氨基酸和呈鮮核苷酸具有協(xié)同增鮮作用，等鮮濃度值（EUC）從量化上衡量了它們之間的協(xié)同作用。經(jīng)計(jì)算，‘L808’和 ww808菌株的 EUC值分別為 38.70 g MSG/（100 g）和 53.38 g MSG/（100 g），‘L808’菌株的鮮味不及ww808菌株，其EUC值約為ww808菌株的72.49%。2個(gè)香菇菌株鮮味均處于第3水平［10—100 g MSG/（100 g）］［28-29］。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)北方香菇栽培基地主栽品種‘L808’菌株及其突變菌株ww808蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和呈味物質(zhì)進(jìn)行了研究與分析?！甃808’菌株的第一限制氨基酸是Met＋Cys，這與楊琴等［30］研究結(jié)果一致。ww808菌株子實(shí)體蛋白中Met＋Cys的AAS值和CS值高于‘L808’菌株，Met和Cys均是含硫氨基酸，表明ww808菌株子實(shí)體的含硫氨基酸較‘L808’菌株更豐富。其中蛋氨酸是必需氨基酸，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成半胱氨酸或胱氨酸，但此反應(yīng)不可逆轉(zhuǎn)。含硫氨基酸不僅是食品中硫的主要供體，如為體內(nèi)輔酶A和牛磺酸等含硫化合物提供硫原子，而且可以抑制食品褐變及美拉德反應(yīng)，從而防止食品風(fēng)味受到影響和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。含硫化合物是食品風(fēng)味的一大主體，含硫氨基酸及其衍生物是大多數(shù)含硫風(fēng)味化合物的直接或間接前體物質(zhì)，蛋氨酸加熱可分解為有清香氣味的二甲硫醚，半胱氨酸受熱可降解產(chǎn)生氨、硫化氫和乙醛，它們都影響著食品產(chǎn)生香氣。從筆者對(duì)兩菌株揮發(fā)性風(fēng)味成分分析結(jié)果可知，ww808菌株的含硫化合物在菌絲體階段僅為‘L808’菌株的9.16%，而到子實(shí)體階段其含量是‘L808’菌株的64.61%［7］，其原因是否與ww808菌株子實(shí)體的含硫氨基酸含量較豐富有關(guān)有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。除Met＋Cys之外，‘L808’菌株子實(shí)體蛋白中其他必需氨基酸的AAS值、CS值及EAAI值均遠(yuǎn)高于ww808菌株。綜合可知，‘L808’菌株子實(shí)體蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)較ww808菌株更均衡、相互之間的比例更優(yōu)。

本試驗(yàn)表明，兩菌株子實(shí)體中呈味物質(zhì)的種類相同，因此其滋味差異主要體現(xiàn)在呈味物質(zhì)的含量及強(qiáng)度上?？扇苄蕴牵ù迹┦鞘秤镁a(chǎn)生甜味的主要物質(zhì)，其種類以及含量直接影響食用菌的滋味與口感。甘露醇是一類新型的低能量甜味劑，能夠預(yù)防齲齒，適合糖尿病患者、肥胖者使用；阿拉伯糖醇是生產(chǎn)木糖醇的重要中間體；海藻糖甜度較低，近年來常被應(yīng)用于食品中?！甃808’菌株子實(shí)體的阿拉伯糖醇、海藻糖等可溶性糖（醇）含量比ww808菌株更高，因此‘L808’菌株子實(shí)體甜味強(qiáng)度更大。ww808菌株子實(shí)體中檢測(cè)到的有機(jī)酸含量均較‘L808’菌株高，特別是琥珀酸含量相差較大，琥珀酸及其鈉鹽具有較好的呈鮮效果，被廣泛應(yīng)用于呈鮮劑；蘋果酸具有提神的酸度和微苦味。兩菌株中乙酸、檸檬酸和延胡索酸含量較低，其中乙酸味道較刺激，檸檬酸具有清新的酸味，延胡索酸具有水果味，可作為飲料等的酸味劑，這些有機(jī)酸均在一定程度上影響著它們的呈味。氨基酸在人體新陳代謝中起著重要的作用，其呈味特性主要是鮮味、甜味、苦味和無味。Chen等［31］研究表明，呈苦味的氨基酸不具有味覺活性，高含量的可溶性糖（醇）產(chǎn)生的甜味可能將苦味成分遮掩；KOMATA等［32］研究表明，鮮、甜味氨基酸是香菇子實(shí)體中的主要氨基酸。本試驗(yàn)表明，ww808菌株子實(shí)體中游離氨基酸及呈味核苷酸含量均較‘L808’豐富?！甃808’菌株和 ww808菌株的 EUC值分別為38.70 g MSG/（100 g）和53.38 g MSG/（100 g），‘L808’菌株的 EUC僅為ww808菌株的72.49%，表明ww808菌株中兩類呈鮮成分協(xié)同作用更明顯，ww808菌株鮮味呈鮮效果較‘L808’菌株更突出。綜上并結(jié)合兩菌株揮發(fā)性成分分析，與突變菌株ww808菌株相比，‘L808’菌株的香味更濃郁、蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)更豐富，而ww808菌株滋味更鮮美、EUC值更突出。ww808菌株的香味雖不及‘L808’菌株濃郁，但其滋味更強(qiáng)，仍有一定的商業(yè)價(jià)值，如將其加工制作成調(diào)味品?；趯?duì)香菇濃郁的香味敏感而不食或少食的人群，本試驗(yàn)可為清香/無香型香菇育種方向提供理論支持，也可為進(jìn)一步研究香菇風(fēng)味形成機(jī)理提供參考。