顏夢秋，劉艷芳，唐慶九，吳 迪，李德順，高 坤，楊 焱，張勁松*

（1上海海洋大學，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，上海201403）

紫芝（Ganodermasinense），又稱黑芝、玄芝、木芝、中國靈芝，屬擔子菌門傘菌綱多孔菌目靈芝科靈芝屬，與赤芝同為靈芝正品。紫芝在中國古代早有藥用記載，具有治耳聾、利關(guān)節(jié)、保神、益精氣、堅筋骨的作用?，F(xiàn)代研究表明，紫芝中主要功能成分為多糖、三萜、生物堿等［1］。紫芝多糖是紫芝中起免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的重要功能因子，研究表明紫芝多糖具有抗炎鎮(zhèn)痛［2-3］、免疫調(diào)節(jié)［4-5］、抗腫瘤［6］、抗氧化［5，7-8］以及調(diào)節(jié)腸道微生物［4］等活性。

目前，對紫芝多糖的研究主要集中在多糖的提取方法優(yōu)化和純化工藝改進方面，現(xiàn)已從紫芝中分離獲得20多個多糖組分［9］，分子量分布較為寬泛，主要為103—106級。這類多糖中的大分子量多糖（106級）主要由葡萄糖組成［9-10］；中等分子量多糖（105級）除含有葡萄糖外，還含有少量的甘露糖和半乳糖［11］；小分子量多糖（103—104級）主要由半乳糖、葡萄糖組成，還含有少量的巖藻糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸［5，12-13］。這些信息為紫芝水溶性胞內(nèi)多糖的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究還發(fā)現(xiàn)，相對于赤芝子實體，紫芝子實體中提取獲得水溶性多糖的得率較低［14-15］，提取剩余大量的殘渣還未進行有效利用。據(jù)報道［16］，食用菌細胞壁上含有豐富的多糖成分，可以通過酸堿提取或超微粉碎處理后進一步加以利用。為了明確紫芝細胞壁多糖的特征，本研究以紫芝子實體水提殘渣為研究對象，通過超微粉碎、熱水浸提、分級醇沉得到紫芝細胞壁多糖樣品，并對其多糖得率、單糖組成、分子量分布等特征加以描述，為進一步獲得紫芝細胞壁均一多糖和開發(fā)相關(guān)功能產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫芝子實體（菌株編號305）產(chǎn)于浙江龍泉靈芝栽培基地，60℃烘干至恒重，用粉碎機粉碎后備用。

單糖標品（D-果糖、D-葡萄糖胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸），三氟乙酸購自美國Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

粉碎機（上海淀久公司，DJ-10A），MS105DU分析天平（美國Mettler Toledo公司）、臺式離心機（美國Beckman Coulter公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）、Synergy HT多功能酶標儀（美國Bio-Tex公司）、ICS-2500型高效離子色譜儀（美國Thermo Fisher公司）、Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Waters 2414示差折光檢測儀（美國Waters公司）、八角度激光光散射儀（美國Wyatt公司）。

1.3 紫芝子實體細胞壁多糖的提取

稱取2 000 g紫芝子實體粗顆粒（直徑約5 mm），以1∶10（kg/L）料液比加入蒸餾水，沸水提取2 h。取10 mL提取液離心，上清液通過苯酚-硫酸法［17］測總糖。重復以上提取步驟直至苯酚硫酸法測出的上清液不含糖時（共提取6次），停止提取。濾布過濾提取液，將提取后的殘渣烘干、超微粉碎至200目（0.075 mm孔徑）粉末。稱取1 300 g紫芝超微粉碎末，加入蒸餾水，使料液比為1∶10，沸水浴提取2 h，濾布過濾后，將提取液在10 000g條件下離心20 min，再次以200目（0.075 mm孔徑）4層濾布過濾，保留上清，離心所得的殘渣與濾布過濾濾渣合并，按上述提取方法再提取2次，過濾、離心，合并3次提取上清液，真空減壓濃縮至1.3 L（濃縮比1∶1）。

1.4 紫芝子實體細胞壁粗多糖的制備

在1.3 L的濃縮液中邊攪拌邊加入無水乙醇，使乙醇濃度達到30%（V/V，下同），4℃靜置過夜，10 000g離心30 min后，分別收集沉淀和上清，沉淀用蒸餾水溶解后，90℃水浴揮干乙醇，真空冷凍干燥，命名為GSCW30E。上清進一步邊攪拌邊加入無水乙醇，使乙醇濃度達到50%，按照上述操作靜置過夜，離心，沉淀水溶凍干后得GSCW50E。上清進一步加入無水乙醇，使乙醇濃度達到70%，按照上述操作靜置過夜，離心，沉淀水溶凍干后得GSCW70E。上清液經(jīng)真空減壓濃縮后，90℃水浴揮干乙醇凍干后命名為GSCW70EU。得到的4個組分凍干后稱重，計算多糖的提取得率。

1.5 多糖含量測定

參照左琦等［17］，使用苯酚-硫酸法測定樣品中的多糖含量。

1.6 單糖組成分析

參照Zhou等［18］，采用高效陰離子色譜法，以11種單糖混合標品為對照，測定樣品的單糖組成及不同單糖的摩爾分數(shù)。

1.7 多糖分子量分布測定

采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光散射儀-示差折光檢測儀（High performance size exclusion chromatography-multiple angle laser light scattering detector-refractive index detector，HPSEC-MALLS-RI）聯(lián)用［19］分析多糖的分子量分布范圍。根據(jù)色譜柱的檢測范圍，檢測GSCW30E和GSCW50E的色譜柱條件為TSKgel G6000PWXL（7.8mm×30 cm）和TSKgel G4000PWXL（7.8mm×30 cm）串聯(lián)聯(lián)用；檢測GSCW70E和GSCW70EU的色譜柱條件為TSKgel G4000PWXL（7.8 mm×30 cm）和 TSKgel G2500PWXL（7.8 mm×30 cm）串聯(lián)聯(lián)用，緩沖條件為0.15 mol/L NaNO3和0.05 mol/L NaH2PO4（含有0.02%疊氮鈉，pH調(diào)為7.00）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分步醇沉各組分得率和多糖含量

經(jīng)過分步醇沉得到不同粗多糖組分的總得率為2.00%（表1），其中GSCW70EU的得率最高為1.00%，GSCW70E和GSCW30E的得率相近分別為0.51%和0.40%，GSCW50E的得率只有0.08%。從多糖含量上看，4個組分的多糖含量都較高，其中GSCW30E和GSCW70E的多糖含量分別高達98.99%和97.17%。

表1 分步醇沉各組分得率和多糖含量Table 1 The yield and content of crude polysaccharides fractions by stepw ise ethanol precipitation of fruiting body cell wall of Ganoderma sinense %

2.2 單糖組成分析

運用高效陰離子色譜檢測分步醇沉的單糖組成及其摩爾分數(shù)，以11種單糖混合標品作標準曲線和對照。由表2可知，4個多糖組分均主要由葡萄糖組成，其摩爾分數(shù)為78.26%—94.48%，其中GSCW30E和GSCW50E中的葡萄糖占比最高，均超過90%。除葡萄糖外，各組分還含有少量的木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸以及巖藻糖和葡萄糖胺等單糖，各單糖在不同組分中的比例有所不同。

表2 分步醇沉各組分的單糖組成摩爾分數(shù)Table 2 M olar ratio ofmonosaccharide of crude polysaccharide fractions by stepw ise ethanol precipitation %

2.3 多糖的分子量分布

由表3可見，紫芝子實體胞壁多糖的分子量分布范圍較廣，其重均分子量范圍從0.8×104—135.7×104g/mol，并呈現(xiàn)隨著乙醇濃度的增加，所得沉淀組分分子量逐漸變小的規(guī)律。GSCW30E為大分子量組分，其重均分子量為135.7×104g/mol；GSCW50E包含兩個組分（圖1峰B和峰C），重均分子量分別為132.0×104g/mol和7.5×104g/mol，其中以分子量較小的峰C為主，峰B的分子量與GSCW30E的重均分子量相近，可能是30%乙醇沉淀不完全導致大分子量多糖出現(xiàn)在50%醇沉組分中；GSCW70E和GSCW70EU均為小分子量組分，其重均分子量分別為2.1×104g/mol和0.8×104g/mol。紫芝細胞壁多糖各組分的多分散性系數(shù)為1.2—1.9，為窄分布。

表3 分步醇沉各組分粗多糖的分子量分布特征Table 3 Molecular weight distribution of crude polysaccharide samples obtained by stepwise ethanol precipitation

圖1 分步醇沉所得粗多糖的HPSEC圖譜Fig.1 HPSEC spectra of crude G.sinense cellwall polysaccharide samp les obtained by stepw ise ethanol precipitation

3 結(jié)論與討論

研究表明，真菌細胞壁主要由多糖組成［16］，多通過冷凍研磨、高壓均質(zhì)、酸堿提取、高溫處理等方法提取［19］并進一步利用。目前對酵母細胞壁多糖的研究較多，而關(guān)于食藥用菌細胞壁多糖研究較少。本研究通過對紫芝子實體水提殘渣進行超微粉碎后再經(jīng)水提醇沉得到細胞壁多糖組分，總得率達到2%，明顯高于紫芝子實體水溶性胞內(nèi)多糖的提取得率，同時細胞壁多糖各組分的多糖含量（75.33%—98.99%）也顯著高于紫芝子實體水溶性胞內(nèi)多糖各組分的多糖含量（27.78%—47.20%），說明紫芝細胞壁上多糖含量較豐富，獲得的較高純度的多糖也更利于后續(xù)的分離純化。另外，單糖組成分析比較結(jié)果顯示，紫芝細胞壁多糖與其水溶性胞內(nèi)多糖在單糖組成特征上有所不同，細胞壁多糖除了具有與胞內(nèi)多糖相同的五種單糖（巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖）外，還含有少量的葡萄糖胺和葡萄糖醛酸；且胞內(nèi)多糖中以葡萄糖和半乳糖含量較高，而細胞壁多糖中以葡萄糖為主。對細胞壁多糖的結(jié)構(gòu)解析將在后續(xù)工作中進行。

據(jù)報道，紫芝菌絲體和子實體多糖都有較好的增強免疫活性，可以促進巨噬細胞中細胞因子的分泌［20］，也有研究表明猴頭菌細胞壁多糖具有刺激鼠巨噬細胞釋放NO的作用［21］。因此，本研究過程中也考察了四種細胞壁多糖組分刺激小鼠巨噬細胞Raw 264.7分泌NO的作用，以及對分化的THP-1細胞分泌TNF-α的影響，結(jié)果顯示四種組分均無明顯作用，初步判斷紫芝細胞壁多糖的體外活性不同于菌絲體多糖和子實體多糖［22］，其生物活性有待進一步研究。