張 斌,蔣春茂,武彩紅*,邱樹磊,陳曉蘭,姚 靜,李 玲,劉 莉
(1江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,泰州225300;2無錫市農(nóng)業(yè)委員會農(nóng)業(yè)信息服務(wù)中心,無錫214000)
姜曲海豬具有適應(yīng)力強(qiáng)、耐粗飼、肉品好和產(chǎn)仔多等特點(diǎn)[1],已被列為我國優(yōu)良的地方豬種。但隨著市場化深入發(fā)展,我國大量引入外來豬種,加之對姜曲海豬缺乏有效保護(hù),導(dǎo)致其品種面臨退化,數(shù)量急劇下降,因此,姜曲海豬種質(zhì)資源保護(hù)逐漸受到關(guān)注。精子冷凍保存是優(yōu)良豬種種質(zhì)資源保護(hù)的有效方法之一,但豬精子對低溫尤其敏感,冷凍-解凍后精子存在活力差、受胎低、產(chǎn)仔少等問題[2-3]。目前,許多學(xué)者的研究集中于豬精液冷凍保存方案的篩選,但因冷凍損傷機(jī)理不明,致使豬精液冷凍保存方案仍未取得顯著進(jìn)展。
雙向凝膠電泳(2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要手段,是根據(jù)等電點(diǎn)和相對分子量的不同而分離蛋白質(zhì)的技術(shù)[4-5]。本研究運(yùn)用2-DE技術(shù)對凍融前后姜曲海豬精子的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分離,同時,對其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和功能分析,從蛋白水平角度揭示豬精子冷凍損傷機(jī)理,為優(yōu)化姜曲海豬精液超低溫冷凍保存方案奠定基礎(chǔ)。
利用假陰道法于無菌條件下分別采集4只健康、性成熟的姜曲海公豬精液,將采集的精液充分混勻,加入1.5倍預(yù)溫稀釋液(德國米尼圖MII稀釋劑按說明書配制)混勻,置于保溫桶中于1 h內(nèi)帶回實驗室。評定精子形態(tài)完整率和活率,分別達(dá)到80%和70%以上時可用于試驗。
1.2.1 精液冷凍
稀釋后精液于17℃過夜、離心(800g,12 min),棄上清后加入冷凍I液(海藻糖375 mmol/L,葡萄糖1.1 g,檸檬酸鈉1.48 g,Tris 2.42 g,青霉素0.06 g,鏈霉素0.1 g,20%卵黃,蒸餾水定容至100 mL),4℃平衡1.5 h后加入等體積4℃預(yù)冷的冷凍II液(冷凍I液中添加甘油,使其體積終濃度為3%),4℃繼續(xù)平衡45 min,分裝于0.25 mL細(xì)管內(nèi),置于距液氮面5 cm高度處熏蒸預(yù)冷10 min,然后投入液氮保存至少一周。
1.2.2 精子解凍
從液氮中迅速取出細(xì)管,投入37℃水浴中并輕輕充分晃動以使其迅速解凍。解凍后的精液收集于10 mL試管內(nèi),用9倍體積的PBS液對其進(jìn)行清洗。
采用改進(jìn)的熱Trizol法提取豬精子蛋白[6]。精液經(jīng)核酸酶處理后,加入預(yù)冷的三氯醋酸-丙酮溶液作用2 h,離心、棄上清,再加入預(yù)冷的丙酮作用30 min洗滌沉淀,反復(fù)洗滌3次;去除丙酮,加入裂解液500μL(2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素,20 mmol/L Tris-HCL,2%(M/V)丙基硫酸鹽(CHAPS),2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1 mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF),10 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)),冰浴超聲 5 min;離心(15℃,20 000g,30 min),收集上清,利用2-D Quant-kit試劑盒(GE公司,美國)進(jìn)行精子蛋白含量測定。
1.4.1 第一向等點(diǎn)聚焦
采用18 cm長、pH 3—10的干性膠條,取200μg蛋白提取液與水化緩沖液[2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素,50 mmol/L DTT,4%CHAPS,0.8%膠條緩沖液(IPG Buffer,痕量溴酚藍(lán))]相混合至總體積為300μL,覆蓋3 mL礦物油后進(jìn)行等電聚焦。
等電聚焦結(jié)束后取出膠條,分別置于平衡A液[2%SDS,6 mol/L尿素,20%甘油,0.375 mol/L Tri-HCl(pH 8.8),1%DTT]、B液[以4%碘乙酰胺(IAM)代替 1%DTT]中,于低速搖床上各平衡 15 min。
1.4.2 第二向SDS-PAG電泳
經(jīng)平衡后的膠條移至12%聚丙烯酰胺凝膠處,排除氣泡使二者接觸緊密,在膠條一側(cè)加蛋白質(zhì)Marker,用0.5%瓊脂糖封固膠條,待溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底,結(jié)束電泳。
1.4.3 凝膠染色及膠圖分析
凝膠參照Zhao等[7]方法進(jìn)行硝酸銀染色。銀染后的凝膠圖經(jīng)軟件(ImageMaster 2D platinum 5.0)分析,再將同一樣品的3張膠圖擬合成1張?zhí)摂M膠圖進(jìn)行定量分析。
采用MALDITof/Tof質(zhì)譜儀檢測3倍以上的蛋白差異點(diǎn),進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),再利用Mascot軟件在線搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫鑒定差異蛋白。
應(yīng)用blast2 go軟件進(jìn)行搜索,并進(jìn)行蛋白質(zhì)GO注釋分析和GO注釋富集分析。其中,“test”為不同精子差異蛋白質(zhì),“reference”為鑒定所獲得的全部蛋白質(zhì),相應(yīng)的P值則利用超幾何概率分布計算獲得,最后選擇GO層次匯總。分別對3個生物學(xué)功能進(jìn)行分析,包括BP(Biological process,生物過程)、CC(Cellular component,細(xì)胞組分)和 MF(Molecular function,分子功能)。
精子蛋白濃度與吸光度值呈線性關(guān)系,y=-215.5x+121.3(R2=0.995),符合樣品蛋白質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),說明提取的精子蛋白濃度穩(wěn)定,可用作雙向電泳分離。姜曲海公豬新鮮精子蛋白含量為18.3μg/μL,凍融后其蛋白含量為15.6μg/μL。凍融前后姜曲海豬精子雙向電泳圖譜見圖1和圖2。比較分析蛋白圖譜發(fā)現(xiàn),有42個蛋白點(diǎn)存在差異,其中3倍以上差異點(diǎn)31個。
圖1 新鮮姜曲海豬精子蛋白2-DE圖譜Fig.1 2-DE map of sperm proteins fromfresh Jiangquhai boar semen
圖2 凍融姜曲海豬精子蛋白2-DE圖譜Fig.2 2-DE map of sperm proteins from frozenthawed Jiangquhai boar semen
蛋白差異點(diǎn)經(jīng)MALDI Tof/Tof質(zhì)譜儀鑒定分析,所獲結(jié)果提交至Mascot軟件進(jìn)行在線搜索,在NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索,分析獲得有意義差異蛋白7個(表1),均下調(diào)表達(dá),P<0.05;7個差異蛋白中,包括能量代謝相關(guān)蛋白3個,結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白2個,受精相關(guān)蛋白和酶相關(guān)蛋白各1個。
表1 MALDITof/Tof鑒定姜曲海豬精子凍融前后差異表達(dá)蛋白Table 1 MALDITof/Tof identification of differential sperm proteins between fresh and frozen-thawed Jiangquhai boar semen
采用Blast2 go軟件進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果表明,凍融前后姜曲海豬精子差異表達(dá)蛋白質(zhì)所處的細(xì)胞組分為細(xì)胞、細(xì)胞器、超分子纖維、膜和細(xì)胞連接等;其執(zhí)行的分子功能比較廣泛,包括裝配、催化、結(jié)構(gòu)分子活性、調(diào)節(jié)分子功能、抗氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)等;參與的生物學(xué)過程包括生長、發(fā)育、繁殖、免疫、解毒、運(yùn)輸、代謝等(圖3)。
圖3 凍融前后姜曲海豬精子差異表達(dá)蛋白GO功能注釋Fig.3 Gene ontology analysis of differentially expressed Jiangquhai boar sperm proteins before and after freezing
在鑒定獲得有意義的差異表達(dá)蛋白中,能量代謝蛋白差異表達(dá)比例最高,包括電壓依賴性陰離子通道蛋白2(VDAC2)、烯醇酶(ENO)和二氫硫辛酸脫氫酶(PDC3)。
VDAC存在于真核生物的線粒體外膜。哺乳動物VDAC包括VDAC1、VDAC2和VDAC3等3種不同的蛋白亞型[8]。其中,VDAC2存在于精子頭部頂體區(qū)域[9],參與精子發(fā)生能量代謝調(diào)控[10]。王增軍等[11]研究表明,人精子膜表面鑲嵌的VDAC蛋白質(zhì)調(diào)控精子膜內(nèi)外的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),對精子的運(yùn)動和功能具有重要作用。Sampson等[12]研究表明,位于線粒體外膜上的VDAC2,參與調(diào)節(jié)線粒體Ca2+的內(nèi)流與外流,揭示了VDAC2在維持精子正?;顒幽芰χ械淖饔?。烯醇酶(ENO)在催化糖酵解反應(yīng)、參與基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮積極作用[13],但作用機(jī)制尚未清楚。Force等[14]研究發(fā)現(xiàn),成熟精子的烯醇酶含量豐富。李鴻巖等[15]研究表明,凍融后綿羊精子ENO表達(dá)下調(diào),且ENO可能與冷凍造成的精子活力的改變有關(guān)。PDC3是組成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)的3個亞單位之一。而PDC是一組限速酶,是線粒體內(nèi)將丙酮酸轉(zhuǎn)換成乙酰輔酶A的重要酶,且將糖酵解與三羧酸循環(huán)以及ATP的生產(chǎn)緊密聯(lián)系在一起,在細(xì)胞線粒體呼吸鏈能量代謝中起著重要的作用[16]。本研究中,凍融姜曲海豬精子VDAC2、ENO和PDC3表達(dá)均下調(diào),推測其不能為精子提供足夠的運(yùn)動所需能量,從而導(dǎo)致精子的活力和受精能力降低。
在鑒定獲得有意義的差異表達(dá)蛋白中,第二大類別為精子結(jié)構(gòu)蛋白,分別為β-微管蛋白和外致密纖維蛋白 2(Outer dense fiber protein 2,ODF2)。
β-微管蛋白與α-微管蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的重要成分,發(fā)揮固定和支撐細(xì)胞形態(tài)的功能,維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu),負(fù)責(zé)軸絲遷移和鞭毛運(yùn)動,參與物質(zhì)運(yùn)輸[17]。本研究發(fā)現(xiàn),凍融后姜曲海豬精子β-微管蛋白下調(diào)表達(dá),可能是凍融過程誘發(fā)微管蛋白發(fā)生解聚,導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)損傷,精子存活率降低。張欣宗等[18]研究發(fā)現(xiàn),低溫冷凍使人精子的微管蛋白上調(diào)表達(dá),與本研究結(jié)果不一致,其原因有待進(jìn)一步研究。
ODF2存在于精子尾部,具有保持精子鞭毛的彈性、參與精子鞭毛構(gòu)成及能量代謝的功能,進(jìn)而保證精子的正常運(yùn)動與受精[19]。Mariappa等[20]研究表明,ODF2與精子形態(tài)、受精及受精卵的發(fā)育密切相關(guān)。ODF2也是精子中心體、體細(xì)胞中心體和紡錘體的組成部分[21]。因此,本研究中,凍融后姜曲海豬精子ODF2表達(dá)下調(diào),一方面可能導(dǎo)致精子活力降低或結(jié)構(gòu)畸形而造成受精失敗,另一方面也可能影響受精卵紡錘體形成而使卵裂失敗。
頂體素結(jié)合蛋白(ACRBP)是一種高度保守的哺乳動物蛋白,位于精子頭部,具有與精子前頂體結(jié)合和包裝組合頂體素酶原的功能,與頂體反應(yīng)有關(guān)[22]。Arcelay等[23]研究發(fā)現(xiàn),ACRBP均勻分布于未獲能精子頭部頂體內(nèi),而精子獲能后,ACRBP分布在精子頂體膜上或以顆粒的形式散在頂體內(nèi)。可見,精子頭部ACRBP的分布與精子是否獲能有關(guān)。研究表明,低溫冷凍精子發(fā)生了獲能反應(yīng),頂體蛋白酶原ACRBP發(fā)生了酪氨酸磷酸化[24]。本研究表明,凍融后姜曲海豬精子ACRBP表達(dá)下調(diào),可能是冷凍導(dǎo)致精子提前獲能所致。
谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)特異催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應(yīng),具有清除脂質(zhì)過氧化物、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[25]。GSH-Px同超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)構(gòu)成精子防御活性氧(ROS)的主要酶系,其濃度與 ROS清除效率有關(guān)[26]。王艷華等[27]研究表明,山羊精液冷凍過程中抗氧化酶活性降低與精子細(xì)胞膜完整性損傷密切相關(guān)。本研究中,凍融精子GSH-Px表達(dá)量降低,可能導(dǎo)致其抗氧化活性降低,清除ROS效率降低,精子質(zhì)膜的損傷程度增加。
本研究表明,凍融后精子蛋白質(zhì)總含量降低,鑒定獲得的有意義差異蛋白涉及能量代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)裝配、受精和抗氧化等生物過程。凍融影響精子能量代謝、細(xì)胞骨架、抗氧化活性和受精能力,但差異蛋白質(zhì)下調(diào)如何影響精子功能和受精胚胎發(fā)育,還需進(jìn)一步深入研究。