凌紅麗，郭佳宏，夏 葉，蔣貽海，魏 波，繆德年*

（1青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島266001；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海201106）

在畜禽生產(chǎn)中使用抗生素等獸藥或飼料添加劑是保障畜禽健康和生產(chǎn)效益的有效措施，但長期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥、藥物殘留等重大問題。隨著國內(nèi)外禁止抗生素使用法規(guī)的出臺(tái)，抗生素作為飼料添加劑必將退出歷史舞臺(tái)。研究開發(fā)新型抗菌劑代替抗生素成為當(dāng)前畜牧獸醫(yī)科技工作者的重要工作。抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP）又名抗微生物肽（Antimicrobial peptide，AMP），是一類由生物體產(chǎn)生的、具有多種生物活性的小分子多肽，具有代替抗生素的潛力［1］。但抗菌肽應(yīng)用于臨床還面臨兩大瓶頸問題，一是對(duì)病原菌的殺滅活性尚不夠高，二是對(duì)真核生物細(xì)胞具有一定的毒性。因此，從這兩方面進(jìn)行改進(jìn)完善是研究設(shè)計(jì)抗菌肽分子的焦點(diǎn)。人工研究設(shè)計(jì)的抗菌肽具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，目前抗菌肽的研究設(shè)計(jì)重點(diǎn)在改變抗菌肽兩性分子中α-螺旋的氨基酸組成，增強(qiáng)其螺旋度；將帶電的氨基酸引入抗菌肽片段來增加其帶電荷數(shù)，以得到活性更高、抗菌譜更廣的抗菌肽［2-9］。

本試驗(yàn)通過互聯(lián)網(wǎng)和計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)了具有良好抗菌活性的抗菌肽CAMa，并實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中的高效表達(dá)，通過研究CAMa對(duì)豬生產(chǎn)性能及腹瀉發(fā)病率的影響，以期為抗生素替代品的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。Zeocin、pPICZαA、畢赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）宿主菌X-33購自Invitrogen公司。大腸桿菌K88、K99、987P和K12D31、金黃色葡萄球菌CowanI、豬沙門氏菌C782購自中國獸藥監(jiān)察所。凝膠DNA純化試劑盒Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、高保真的DNA聚合酶PrimeSTAR?HSDNA Polymerase、T4 DNA連接酶和各種限制性核酸內(nèi)切酶均購自Takara公司。低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購自Sigma-aldrich公司（M3546）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 抗菌肽的設(shè)計(jì)與基因合成

以抗菌肽Cecropin A和Magainin的氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl？page＝npsa＿sopma.html）、蛋白理化特性分析工具（http：//www.expasy.org/）和抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD的在線預(yù)測和設(shè)計(jì)工具（http：//aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction＿main.php）對(duì)所設(shè)計(jì)抗菌肽的抗菌活性進(jìn)行預(yù)測，設(shè)計(jì)了一種新型抗菌肽CAMa，選用酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)抗菌肽CAMa基因，在其N端加上α信號(hào)肽Kex2裂解位點(diǎn)，并分別在兩端引入XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)?；蚱斡缮虾＝萑鹕锕こ逃邢薰竞铣?。

1.3 宿主轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定

分別用XhoI和XbaI將抗菌肽基因片段和宿主轉(zhuǎn)移載體pPICZαA酶切，回收目的片段，T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Zeocin＋的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)16—24 h。挑單菌落，用特異引物 CAMa1（5-CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGC-3）和 CAMa2（5-CGCTCTAGATCAGAACTTCTTCTTACTGTGC-3）進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌株送大連Takara公司測序，最終獲得含有目的片段的重組載體pPICZαA-CAMa。

1.4 酵母菌株的電轉(zhuǎn)化與重組菌的鑒定

將SacI單酶切線性化的質(zhì)粒 pPICZαA-CAMa，加入酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞懸液中，1.5 kV、25μF、200Ω電擊轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化物均勻涂布于含Zeocin的YPDS選擇平板上，30℃孵育3—5 d。待YPDS平板上的陽性轉(zhuǎn)化子生長到較大時(shí)，將各轉(zhuǎn)化子依次點(diǎn)種至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1 000μg/mL的YPDS選擇平板，在高濃度Zeocin平板上正常生長的菌落作為高拷貝重組菌株。提取篩選到的高拷貝重組菌株基因組DNA，利用鑒定引物CAMa1和pAOX2（5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3）進(jìn)行PCR鑒定。上游引物CAMa1位于插入片段抗菌肽基因區(qū)，下游引物AOX2位于畢赤酵母3’AOX基因區(qū)，引物由大連Takara公司合成。

1.5 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

挑取篩選到的陽性重組菌單菌落，接種于含100μg/mL Zeocin的YPD培養(yǎng)液中，30℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。取此菌液按1%體積比轉(zhuǎn)接于20 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30℃、200—220 r/min培養(yǎng)18—24 h，轉(zhuǎn)接于100 mL BMMY培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳和抑菌活性測定。

1.6 重組抗菌肽抗菌活性的初步測定

采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以大腸桿菌K88、K99、987P、K12D31、金黃色葡萄球菌CowanI、豬沙門氏菌C782作為試驗(yàn)菌株，將處于對(duì)數(shù)生長期的供試菌懸浮液（稀釋平板計(jì)數(shù)法測定：109個(gè)/mL）20μL與55℃的LB固體培養(yǎng)基20 mL混勻后鋪板，待其凝固后，用滅菌直徑5mm的打孔器打孔，孔中滴加50μL待測樣品，37℃培養(yǎng)過夜，第2天觀察抑菌圈，同時(shí)設(shè)100μg/mL氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）和鏈霉素（Streptomycin，S）為陽性對(duì)照。

1.7 抗菌肽溶血活性的測定

分別將重懸于PBS中的8%豬紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞100μL加入96孔板中，再加入PBS系列稀釋的抗菌肽100μL，使各孔中抗菌肽的質(zhì)量體積濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL。陽性對(duì)照孔加入100μL 0.2%Triton X-100，陰性對(duì)照孔加100μL PBS，37℃孵育1 h后，3 000 r/min離心5 min，從各孔吸取100μL上清液到另一96孔板中，550 nm波長測定OD值，溶血比＝［（實(shí)驗(yàn)孔OD值-陰性孔OD值）/（陽性孔OD值-陰性孔OD值）］×100%。

1.8 抗菌肽替代抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用試驗(yàn)

試驗(yàn)在上海某種豬場進(jìn)行，仔豬為長白母豬與大約克種公豬雜交所產(chǎn)二元雜交種。挑選體重相近的25日齡剛斷奶健康仔豬64頭，隨機(jī)分成2組，2個(gè)組的基礎(chǔ)飼糧相同?？股貙?duì)照組在基礎(chǔ)飼糧中添加相應(yīng)劑量飼用抗生素（0.12%的10%硫酸抗敵素預(yù)混劑），試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中添加相應(yīng)劑量抗菌肽（0.4%抗菌肽）。試驗(yàn)所使用的10%硫酸抗敵素預(yù)混劑由浙江升華拜克生物股份有限公司生產(chǎn)，其中預(yù)混料不含其他任何抗菌促生長藥物。飼料定量供應(yīng)，自由飲水，常規(guī)方式管理，所有仔豬按正常的免疫程序接種疫苗。

在整個(gè)試驗(yàn)期間，觀察試驗(yàn)豬群（試驗(yàn)組和對(duì)照組）仔豬的健康狀況，包括皮膚、被毛和眼分泌物，并記錄仔豬試驗(yàn)期間的死亡頭數(shù)、腹瀉發(fā)生情況、其他疾病的發(fā)生情況等指標(biāo)；分別于25日齡斷奶時(shí)、58日齡小保育后逐頭稱重，記錄各組仔豬平均體重、平均增重、飼料消耗量及料重比。

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽CAM a的設(shè)計(jì)與基因合成

綜合等電點(diǎn)、脂溶指數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、兩親性和抗菌活性分析預(yù)測，設(shè)計(jì)了一種新型抗菌肽CAMa。CAMa的GRAVY和Aliphatic index分別為-1.024和55.71。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主。疏水性氨基酸7個(gè)，親水性氨基酸11個(gè)，疏水性和親水性氨基酸也大體分別均勻分布在螺旋的兩側(cè)。蛋白結(jié)合勢能為1.43 kcal/mol。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-CAM a的構(gòu)建與鑒定

PCR電泳結(jié)果顯示所挑選的菌落均能擴(kuò)增出約90 bp的DNA片段（圖1），表明抗菌肽CAMa基因已經(jīng)成功地連接到轉(zhuǎn)移載體上。測序結(jié)果也表明目的片段已正確插入穿梭載體pPICZαA-CAMa中。

圖1 重組載體中抗菌肽CAMa基因的PCR鑒定Fig.1 Identification of CAMa gene in recombinant vectors by PCR

2.3 抗菌肽CAM a重組酵母菌株的PCR鑒定

在高濃度Zeocin平板挑取兩個(gè)pPICZαA-CAMa/X-33重組菌落，提取重組菌的基因組作模板，均擴(kuò)增出254 bp的DNA片段。表明CAMa基因已經(jīng)成功地整合到酵母菌X-33的基因組上（圖2）。

圖2 重組酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.2 Identification of yeast genome DNA by PCR

2.4 陽性重組菌pPICZαA-CAM a/X-33的誘導(dǎo)表達(dá)

重組的pPICZαA-CAMa/X-33酵母菌經(jīng)0.5%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)上清液經(jīng)初步分離純化后進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，擴(kuò)增出一條約3.5 ku的特異性條帶（圖3）。

圖3 SDS-PAGE電流分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis

2.5 重組抗菌肽CAM a抗菌活性的初步測定

由表1可知，新型抗菌肽CAMa對(duì)革蘭氏陰性的大腸桿菌K88、K99、987P、K12D31菌株及革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌CowanI、豬沙門氏菌C782均有較好的抑殺活性。

表1 CAM a的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of CAM a mm

2.6 抗菌肽溶血活性測定結(jié)果

0.78—100μg/mL重組抗菌肽CAMa對(duì)豬紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞均未表現(xiàn)出明顯的溶血活性。

2.7 抗菌肽CAM a對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

抗菌肽試驗(yàn)組豬較硫酸抗敵素對(duì)照組的增重、平均日增重分別提高了0.1 kg和2.76 g，抗菌肽CAMa稍優(yōu)于硫酸抗敵素。而仔豬增重、平均日增生和料重比差異均不顯著（P＞0.05），表明抗菌肽CAMa制劑對(duì)斷乳仔豬的促生長效果與硫酸抗敵素的效果相當(dāng)（表2）。

表2 抗菌肽CAM a對(duì)斷乳仔豬生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effect of CAM a on grow th performance of weaned piglets

2.8 抗菌肽CAM a對(duì)仔豬腹瀉的影響

抗菌肽試驗(yàn)組與抗生素對(duì)照組相比，仔豬腹瀉發(fā)生率降低，但兩者腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉天數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)組的平均腹瀉天數(shù)為2.0 d，較對(duì)照組的平均腹瀉天數(shù)少0.71 d（表3），說明抗菌肽CAMa在仔豬斷奶應(yīng)激期間抗應(yīng)激腹瀉效果較抗生素稍好。

表3 抗菌肽CAMa對(duì)斷乳仔豬腹瀉的影響Table 3 Effect of CAMa on diarrhea of weaned piglets

3 討論

抗菌肽這類具有明顯優(yōu)勢的新型抗菌藥物已引起業(yè)界的重視，提高抗菌肽的活性和降低其毒性是當(dāng)前研究開發(fā)的難點(diǎn)。隨著對(duì)抗菌肽殺菌機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系的深入認(rèn)識(shí)，研究者們開始嘗試設(shè)計(jì)更廣譜、殺菌能力更強(qiáng)的新型抗菌肽。抗菌肽分子的設(shè)計(jì)是基于抗菌肽結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過一系列生物信息學(xué)方法［7-9］對(duì)天然抗菌肽進(jìn)行定向改造或全新設(shè)計(jì)，來提高抗菌肽的活性并降低其毒性。目前，對(duì)兩親α-螺旋型的抗菌肽構(gòu)效關(guān)系已經(jīng)總結(jié)出一定的規(guī)律，即陽離子性和兩親性［10-11］。帶正電荷的抗菌肽能區(qū)別機(jī)體細(xì)胞兩性離子的細(xì)胞膜和帶負(fù)電細(xì)菌的細(xì)胞膜，優(yōu)先結(jié)合和殺死細(xì)菌；抗菌肽的兩親性決定其能有效融入細(xì)菌的細(xì)胞膜內(nèi)，形成疏水通道。兩親性和疏水性對(duì)于抗菌活性非常重要，保持穩(wěn)定的兩親結(jié)構(gòu)及一定的疏水性才能進(jìn)一步發(fā)揮抗菌肽的活性和選擇性［12］，對(duì)比疏水性和α-螺旋的程度，兩親性顯得更為重要［13-14］。

國內(nèi)外研究者以天然抗菌肽為基礎(chǔ)，通過截取肽鏈N端或C端部分序列，連接不同來源的抗菌肽片段，進(jìn)而組成雜合肽等。Feng等［15］以牛乳鐵蛋白肽和天蠶素B為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一種新的雜合抗菌肽LF15-CA8。Shin等［16］將cecropin A N端的8個(gè)殘基作頭，magainin 2 N端的12個(gè)殘基作尾，合成得到雜合肽cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）。周霞等［17］將天蠶素A-蛙皮肽雜合肽基因抗菌肽的人工基因克隆到具有自切割功能的表達(dá)載體pTYB12上，并在大腸桿菌（E.coli）BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均有一定的抗菌活性。金豐良等［18］、許小霞等［19］、王秀青等［20］和馮惟萍等［21］根據(jù)天蠶素和馬蓋寧的氨基酸序列，分別設(shè)計(jì)了雜合肽 CA（1-8）-M（1-12）、（His）（6）-UBI-CA-MA、CA（1-7）-M（2-12）和W16-CA-MA。本試驗(yàn)以CecropinA和Magainin的氨基酸序列為基礎(chǔ)，分別截取CecropinA和Magainin肽鏈部分序列，通過互聯(lián)網(wǎng)和計(jì)算機(jī)軟件，優(yōu)化陽離子數(shù)和兩親性參數(shù)，設(shè)計(jì)了具有較好抗菌活性的抗菌肽分子CAMa，并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)一些臨床分離的耐藥致病菌株均有明顯的抑制和殺滅作用，為其進(jìn)一步的開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。

硫酸黏桿菌素（Colistinsulfatepremix）屬抗生素類藥，主要使敏感菌細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的重要成分外漏，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。該類藥主要用于豬、雞、牛等，能顯著刺激幼畜生長，提高飼料報(bào)酬，增加養(yǎng)殖效益，預(yù)防畜禽傳染性胃腸炎，防治沙門氏菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌所引起的腸道病。在本試驗(yàn)中，與硫酸抗敵素相比，抗菌肽有提高增重、降低腹瀉率的趨勢，但差異不顯著，抗菌肽CAMa完全可以代替抗生素用于預(yù)防斷乳仔豬腹瀉，是抗生素添加劑的理想替代品，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景。