宋麗麗，張麗勍，高清華，段 可*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海201403）

草莓炭疽病是嚴(yán)重威脅草莓生產(chǎn)的重要病害之一，發(fā)生普遍，分布廣泛，主要危害草莓的葉片、葉柄與匍匐莖，嚴(yán)重時(shí)病菌侵入短縮莖，致使整株凋萎、枯死［1］。草莓炭疽病屬于高溫病害，已成為中國南方草莓產(chǎn)區(qū)育苗的主要障礙［2-3］。2012年夏季，湖北省草莓炭疽病平均發(fā)病率為41.7%，嚴(yán)重田塊發(fā)病率高達(dá) 69%［4］。

膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是引起草莓炭疽病的病原菌之一。膠孢炭疽菌為復(fù)合種，Weir等［5］通過多基因聯(lián)合建樹的方法將膠孢炭疽菌復(fù)合種劃分為22個(gè)種和1個(gè)亞種。果生刺盤孢菌（C.fructicola）是膠孢炭疽菌復(fù)合種之一。Han等［6］研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢菌極易侵染草莓的葉片和葉柄，接種后30 d，草莓植株的死亡率達(dá)到77.8%。目前，國內(nèi)對(duì)果生刺盤孢菌的研究多限于種的鑒定及其遺傳結(jié)構(gòu)［7-9］，而針對(duì)果生刺盤孢菌的生物學(xué)特性及其防治的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)分離自上海和安徽地區(qū)，侵染草莓植株不同部位的果生刺盤孢菌菌株的生物學(xué)特性及其致病性進(jìn)行分析和比較，以期初步了解果生刺盤孢菌的生長(zhǎng)習(xí)性和致病機(jī)理，為進(jìn)一步研究近年草莓炭疽病流行成因及綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株分離自上海市和安徽省具有炭疽病典型癥狀的草莓病株，菌株編號(hào)及來源信息詳見表1。

表1 供試草莓炭疽菌菌株信息Table 1 Information of the tested strawberry anthrax strains

接種草莓材料為來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所經(jīng)過莖尖脫毒的組培苗‘章姬’（易感?。┖汀觋枴共。?。

1.2 草莓炭疽病病原菌的分離與純化

將病樣采回后消毒處理，組織分離參考陳瑤等［10］的方法，處理后將組織置于加有氯霉素的PDA平板上，28℃暗培養(yǎng)3 d。切取菌落邊緣菌絲置于PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床中28℃、200 r/min培養(yǎng)1 d。單孢劃線分離病原菌參考張昊等［11］的方法。單孢菌轉(zhuǎn)接到PDA平板上于28℃培養(yǎng)用于鑒定。

1.3 草莓炭疽病病原菌的鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)特征觀察

對(duì)上海及安徽地區(qū)分離到的炭疽病菌進(jìn)行形態(tài)觀察及比較。用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察記錄菌餅直徑，每個(gè)菌株培養(yǎng)并觀察記錄5皿。參考Cox等［12］的方法搖菌配制適當(dāng)濃度的孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察分生孢子及附著孢形態(tài)，每菌株至少觀察5個(gè)視野，重復(fù)3次。

1.3.2 分子鑒定

病原菌DNA的提?。汗稳⌒迈r菌絲在液氮中磨碎，收集100 mg粉末，使用OMEGA E.Z.N.A.TMFungal DNA Miniprep Kits提取菌株基因組DNA。基因選擇及PCR擴(kuò)增參考Weir等［5］的方法略有改動(dòng)，退火溫度為ITS（55℃）、CAL（62℃）、ACT（61℃）、GAPDH（61℃）、ApMat（61℃），膠孢炭疽菌復(fù)合種種類劃分所用引物見表2。取5μL PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行。

表2 試驗(yàn)所用引物Table 2 Primers used in the experiment

將測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析和手動(dòng)修正，按照ITS-CAL-ACT-GAPDH-ApMat的順序首尾相連。下載GenBank中同時(shí)含有這5個(gè)基因的炭疽菌屬菌株序列及相關(guān)模式菌株序列［18］（表3），同樣按照ITS-CALACT-GAPDH-ApMat的順序首尾相連后進(jìn)行分析。參照李河等［8］方法，選取C.hippeastri作為外群，使用MEGA 7.0軟件，采用最大似然法（ML）構(gòu)建多基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 生物學(xué)特性分析

1.4.1 產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)測(cè)定

參考張敬澤等［19］的方法稍有改動(dòng)，將培養(yǎng)7 d的菌落用直徑為10 mm的打孔器沿邊緣打孔，挑取8個(gè)菌塊置于30 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在搖床28℃、200 r/min搖菌3 d。吸取20μL于載玻片上，在顯微鏡10×鏡下觀察記錄5個(gè)視野的產(chǎn)孢量。同上將孢子懸浮液制成1×106個(gè)/mL，取30μL于載玻片上，使孢子懸浮液的濃度為在顯微鏡10×鏡視野下每個(gè)視野含有45—50個(gè)分生孢子。放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次，在不同時(shí)間（3 h、6 h、24 h）觀察和統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率（孢子萌發(fā)率＝已萌發(fā)的孢子數(shù)/總孢子數(shù)）。

1.4.2 溫度對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

用無菌打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接至新的PDA平板中央后分別置于8個(gè)不同溫度梯度（5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.4.3 pH對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

準(zhǔn)備 1mol/LNaOH和1mol/LHCL溶液，將 PDA培養(yǎng)基的 pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10共8個(gè)梯度，用無菌打孔器沿菌落邊緣打取直徑為6 mm的新鮮菌餅，將新鮮菌餅置于不同pH的PDA平板中央，于28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.4.4 不同碳、氮源對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

參考陳秀蓉等［20］的方法，將直徑為6 mm的新鮮菌餅置于加有20 g/kg不同碳源的PDA培養(yǎng)基中央，或加有2.5 g/kg不同氮源的PDA培養(yǎng)基中央，以不加任何碳源或氮源為對(duì)照，于28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3皿，重復(fù)3次。

1.5 致病性測(cè)定

選取經(jīng)過莖尖脫毒的組培草莓苗‘章姬’（易感?。┖汀觋枴共。鶡捗珩Z化后，移栽于基質(zhì)中，在溫室培養(yǎng)1個(gè)月后，轉(zhuǎn)至HZLED-1000C型智能人工氣候箱（上海皓莊儀器有限公司），適應(yīng)1周后采用噴霧法接種。將不同菌株分離獲得的分生孢子制成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，均勻噴灑于草莓葉片上（以有水滴流下為度），以噴灑無菌水為對(duì)照［21-23］。每處理5株，3次重復(fù)。接種后的草莓植株置于培養(yǎng)箱（25℃）中黑暗覆膜保濕培養(yǎng)24 h，之后揭膜繼續(xù)正常培養(yǎng)（25℃，L/D＝12 h/12 h）。病情分級(jí)與不同菌株致病性等級(jí)的劃分參考王豐等［24］。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0和Excel 2010軟件進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性檢測(cè)采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征觀察

分離自上海及安徽草莓主栽區(qū)的6個(gè)炭疽菌菌株在PDA上培養(yǎng)5 d后，菌落形態(tài)存在一定差異。GQHAH1、GQHAH6、GQH26、GQH133、GQH131菌株菌落隆起，整個(gè)菌落疏松、絮狀，中心深灰或灰綠色，邊緣灰白整齊。GQHAH4菌株菌落較扁平、整個(gè)菌落較致密、絨毛狀、白色、邊緣整齊。分生孢子整體均呈長(zhǎng)橢圓形或一端略尖，光滑，無色，分生孢子在水中萌發(fā)產(chǎn)生芽管后形成梨形、卵形等暗褐色的附著胞，胞內(nèi)分布黑色顆粒狀物，附著胞形態(tài)較穩(wěn)定，大小不均一（圖1）。

圖1 各菌株在PDA培養(yǎng)基（pH＝6.8）上生長(zhǎng)5 d的菌落形態(tài)及40×鏡下觀察的孢子和附著胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology of different strains after cultivation on PDA medium（pH＝6.8）for 5 daysand themorphology of spore and appressorium observed under 40×m icroscope

根據(jù)吳文平等［25］和 LIU等［26］對(duì)真菌的分類依據(jù)，初步鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。

2.2 菌株的分子鑒定

以6個(gè)膠孢炭疽菌菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS（615 bp）、ACT（316 bp）、GAPDH（308 bp）、CAL（756 bp）、ApMat（1 000 bp）基因，得到特異性條帶，符合測(cè)序要求（圖2）。

圖2 6個(gè)菌株的基因（ITS，ACT，GAPDH，CAL，ApMat）鑒定Fig.2 Identification of genes（ITS，ACT，GAPDH，CAL，ApMat）of 6 strains

使用5個(gè)基因（ITS、ACT、GAPDH、CAL、ApMat）的引物，分別擴(kuò)增供試的6個(gè)病原菌，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，采用多基因聯(lián)合建樹法對(duì)其進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，6個(gè)草莓炭疽菌菌株與已報(bào)道的C.fructicola菌株號(hào)為 LC2924、LF131、LC2925、LF132、LC3670、ICMP10642、LF900、LC3368、LF590的菌株處在同一分支上，與已報(bào)道鑒定為C.fructicola的模式菌株ICMP18581及CBS130416歸在一個(gè)種群內(nèi)（圖3）。多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果結(jié)合病原菌形態(tài)特征分析表明，GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6、GQH26、GQH133、GQH131病原菌均為草莓果生刺盤孢菌（C.fructicola）。

圖3 基于ITS、ACT、GAPDH、CAL和ApMat基因聯(lián)合構(gòu)建炭疽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis of anthrax based on ITS，ACT，GAPDH，CAL and ApMat genes

2.3 果生刺盤孢菌的生物學(xué)特性分析

2.3.1 產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率比較

如圖4所示，各菌株在同等條件下的產(chǎn)孢量存在差異。GQH26菌株搖菌3 d后的產(chǎn)孢量最多，達(dá)到291個(gè)，GQHAH4產(chǎn)孢量最少，為104個(gè)（圖4A）。GQH26和GQH131菌株的產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株。不同菌株在3 h、6 h、24 h的孢子萌發(fā)率顯著增高，尤其在6—24 h間增長(zhǎng)明顯。在24 h時(shí)，6個(gè)果生刺盤孢菌菌株的孢子萌發(fā)率接近100%（圖4B）。

圖4 不同菌株在搖菌3 d后的產(chǎn)孢量（A）及不同時(shí)間的孢子萌發(fā)率（B）Fig.4 Sporulation capacity of different C.fructicola strains after 3 days’culture（A）and spore germ ination rates（B）at different time

2.3.2 溫度對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

如表4所示，在10—35℃范圍內(nèi)，6個(gè)果生刺盤孢菌菌株均能生長(zhǎng)，當(dāng)溫度低至5℃ 或高至40℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，不同菌株的菌落直徑均達(dá)到最大值，表明30℃是較適合草莓果生刺盤孢菌菌絲生長(zhǎng)的溫度。

當(dāng)溫度為15—35℃時(shí)，GQH131與GQHAH1、GQHAH4的菌落直徑有顯著差異；當(dāng)溫度為10℃ 時(shí)，GQH26菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑為1.72 cm，GQH133菌絲生長(zhǎng)最慢，菌落直徑為1.42 cm。由此可見，不同溫度對(duì)果生刺盤孢菌生長(zhǎng)影響不同，這可能與不同菌株對(duì)溫度的適應(yīng)不同有關(guān)。

表4 果生刺盤孢菌菌株在不同溫度下生長(zhǎng)5 d后的菌落直徑Table4 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days under different temperature cm

2.3.3 不同pH對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

如表5所示，pH 3—10時(shí)，草莓果生炭疽病菌均能生長(zhǎng)，而最適菌株生長(zhǎng)的pH為6—7。分離自上海的GQH26、GQH133、GQH131菌株在pH為6時(shí)菌落直徑最大，分離自安徽的GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6菌株在pH為7時(shí)菌落直徑最大?？梢姡煌琾H對(duì)不同的草莓果生刺盤孢菌菌株生長(zhǎng)影響不同。

表5 果生炭疽病菌株在不同pH條件下生長(zhǎng)5 d后的菌落直徑Table 5 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days at different pH cm

2.3.4 碳源對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

供試菌株在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和乳糖為碳源的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)（表6），但菌絲直徑存在顯著差異。菌株GQH26、GQH131、GQH133、GQHAH1、GQHAH6對(duì)碳源的利用偏好順序?yàn)槠咸烟?＞蔗糖＞麥芽糖＞甘露醇＞乳糖；GQHAH4對(duì)碳源的利用偏好順序?yàn)辂溠刻牵菊崽牵酒咸烟牵靖事洞迹救樘恰Ｍ惶荚礂l件下不同菌株的菌落直徑有差異，其中以麥芽糖為碳源時(shí)，GQH131菌株菌落直徑最大，為7.28 cm，GQHAH1菌株菌落直徑最小，為5.92 cm。

表6 果生刺盤孢菌菌株在不同碳源條件下生長(zhǎng)5 d后的菌落直徑Table 6 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days w ith different carbon sources cm

2.3.5 氮源對(duì)各菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

如表7所示，菌株GQH26、GQH131、GQH133對(duì)氮源的利用偏好順序?yàn)殇@鹽＞丙氨酸＞甘氨酸＞L-半胱氨酸＞尿素；GQHAH1、GQHAH4、GQHAH6對(duì)氮源的利用偏好順序?yàn)殇@鹽＞甘氨酸＞丙氨酸＞L-半胱氨酸＞尿素?？梢?，氮源對(duì)不同果生刺盤孢菌菌株菌絲生長(zhǎng)的影響存在差異。

表7 果生刺盤孢菌菌株在不同氮源條件下生長(zhǎng)5 d后的菌落直徑Table 7 Colony diameter of C.fructicola after cultivation for 5 days w ith different nitrogen sources cm

2.3.6 不同果生刺盤孢菌菌株對(duì)草莓葉片的致病性測(cè)定

利用不同菌株接種處理易感病草莓品種‘章姬’和抗病品種‘申陽’（苗齡均為30 d），對(duì)不同菌株的致病性進(jìn)行比較。結(jié)果表明（圖5），GQH131菌株對(duì)‘章姬’的致病力顯著高于其他菌株，病情指數(shù)達(dá)到61.98，而其他5個(gè)菌株的致病性無顯著差異。各菌株對(duì)抗病品種‘申陽’的致病性測(cè)定表明，GQH131菌株對(duì)其致病性顯著高于GQHAH1和GQHAH4，病情指數(shù)為45.45?？梢?，來源不同的果生刺盤孢菌菌株致病性存在一定程度的分化。

圖5 ‘章姬’草莓和‘申陽’草莓接種不同菌株9 d后的病情指數(shù)Fig.5 Disease index of‘Akihime’and‘Shenyang’strawberry inoculated w ith different strains for 9 days

3 討論

草莓是國內(nèi)外重要的小水果之一，近年來隨著全國范圍內(nèi)草莓種植面積的擴(kuò)大，設(shè)施密閉及高溫高濕環(huán)境等導(dǎo)致草莓炭疽病發(fā)生日益嚴(yán)重，造成草莓減產(chǎn)25%—30%［27］，嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)。草莓炭疽病是草莓生產(chǎn)中的一種重要病害，草莓炭疽病的主要病原菌有草莓炭疽菌（C.fragariae）、膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）［28］，均為復(fù)合種群，群內(nèi)種類多，種間菌株變異較大。

傳統(tǒng)的真菌分類主要基于形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，但對(duì)于像炭疽菌屬這類近似種之間差異微小，且隨著寄主與病原菌之間相互協(xié)同進(jìn)化，形態(tài)上的分類標(biāo)準(zhǔn)更為模糊［29］。同時(shí)，單一的ITS序列分析對(duì)多數(shù)近緣種和復(fù)合種構(gòu)建的系統(tǒng)樹在一些關(guān)鍵進(jìn)化節(jié)點(diǎn)的支持率較低，不能進(jìn)行識(shí)別［30］。而多基因聚合鑒定比單基因鑒定更加有效，使得基因樹更能準(zhǔn)確地推測(cè)物種，特別是近緣物種的系統(tǒng)關(guān)系［31］。采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和ITS序列分析，對(duì)于研究膠孢炭疽菌這樣的復(fù)合種內(nèi)的遺傳關(guān)系結(jié)果十分不可靠。本試驗(yàn)利用多基因聯(lián)合建樹法對(duì)分離自上海和安徽不同組織器官的草莓炭疽病菌進(jìn)行進(jìn)一步的分子鑒定，結(jié)果顯示試驗(yàn)菌株均與果生刺盤孢菌（C.fructicola）歸為一個(gè)種群。結(jié)合病原菌形態(tài)特征，鑒定試驗(yàn)所用6個(gè)菌株為果生刺盤孢菌。

對(duì)果生刺盤孢菌生物學(xué)特性分析表明，草莓果生刺盤孢菌對(duì)溫度、pH等適應(yīng)范圍廣，在溫度10—35℃及pH 3—10均能生長(zhǎng)。較適溫度為25—30℃，溫度低于5℃或高于40℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與張海英等［32］對(duì)草莓炭疽菌生物學(xué)特性的研究略有差異，張海英等認(rèn)為草莓炭疽病病原菌最適溫度為25℃，這可能與不同來源及不同菌種的病菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍不同有關(guān)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)草莓果生刺盤孢菌最適pH為6—7，與任小杰［33］對(duì)草莓炭疽菌的研究、楊成德等［34］對(duì)馬鈴薯炭疽病菌的研究結(jié)論一致。此外，本試驗(yàn)表明，果生刺盤孢菌能利用多種碳氮源。在不同碳源中，各菌株對(duì)碳源的利用略有差異，其中葡萄糖和蔗糖較適合該菌的生長(zhǎng)；在不同氮源中，菌絲在銨鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，尿素培養(yǎng)基最慢。

從草莓果生刺盤孢菌接種抗病性不同的草莓品種‘章姬’和‘申陽’葉片后的病情指數(shù)來看，不同菌株的致病力存在一定差異。對(duì)易感品種‘章姬’的致病性顯示，GQH131與其他5個(gè)菌株有顯著差異；而對(duì)抗病品種‘申陽’的致病性僅GQH131與GQHAH1、GQHAH4有顯著差異。說明來源不同的菌株在進(jìn)化過程中，其致病性產(chǎn)生了一定程度的分化，且不同品種的草莓對(duì)菌株的抗病性存在差異。

本研究可為生產(chǎn)上防治草莓炭疽病提供參考，當(dāng)溫度為25—30℃ 時(shí)，需加強(qiáng)對(duì)該病害的防控。Freeman等［35］報(bào)道，炭疽病可在無菌的土壤中存活至少1年，這與其廣泛的適應(yīng)性有關(guān)。另外，不同草莓果生刺盤孢菌在生物學(xué)特性也有一定差異，生產(chǎn)上應(yīng)該因地制宜地指導(dǎo)不同地區(qū)草莓果生刺盤孢菌的科學(xué)防控。本研究分離菌株數(shù)量有限，關(guān)于不同來源的草莓果生刺盤孢菌生物學(xué)特性和致病性分化情況，尚待大量收集不同地區(qū)的病原菌，結(jié)合室內(nèi)觀測(cè)和田間小區(qū)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究，以此更好地指導(dǎo)田間種植防護(hù)工作。