曹程浩,韓麗華,張會超

(河南省中醫(yī)院心病科,鄭州 450000)

慢性充血性心力衰竭(簡稱心衰)是各種心臟病的終末階段,多發(fā)生于中老年人,長期的缺血和再灌注損傷導(dǎo)致心肌細胞壞死,心肌組織纖維化增生和心室結(jié)構(gòu)重塑,患者5 年內(nèi)病死率極高[1]。 近年,線粒體自噬與心血管疾病的關(guān)系受到廣泛關(guān)注,心力衰竭患者心臟組織活檢結(jié)果顯示自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(LC3)Ⅱ表達升高,且其變化程度可能受到線粒體融合蛋白2 的調(diào)控[2]。 進一步研究表明,適當(dāng)?shù)木€粒體自噬對清除功能喪失線粒體,維持心肌細胞能量供應(yīng)至關(guān)重要,線粒體自噬活性過高則可能清除健康線粒體導(dǎo)致能量供應(yīng)不足和代謝功能障礙[3]。 本課題組應(yīng)用溫陽益氣方治療心衰多年,并證實該藥在改善梗死后心衰大鼠的心室重構(gòu)方面具有積極作用,但其藥理機制尚不明確。 本研究從線粒體自噬入手,觀察溫陽益氣方對梗死后大鼠腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)介導(dǎo)的線粒體自噬的影響,為完善其藥理機制奠定數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康清潔級Wistar 大鼠100 只,雌雄各半,月齡6～8,體重(220±20)g,購自山東魯抗動物中心[SCXK(魯)2015-0001]。 所有大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物房[SYXK(豫)2015-0017],常規(guī)飼養(yǎng),自由進食進水,溫度22℃～25℃,濕度40% ～60%。 本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(審批號：20151016),實驗期間按照3R 原則給予實驗動物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

溫陽益氣方：為自制中藥粉劑,每1 g 干粉含有原生藥3 g,其中附子0.50 g,肉桂0.50 g,紅參1.0 g,黃芪1.0 g。 AMPK 激動劑EX229(美國Selleck Chemicals 公司,批號20150122);戊巴比妥鈉(北京嵐泰化工科技有限公司,批號20141125);總蛋白質(zhì)抽提試劑盒、BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒、ECL顯色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司,批號依次為20150608、20151122、20141122);自噬相關(guān)標(biāo) 志 物 p-AMPK、 AMPK、 LC3II、 LC3I、 PINK1、Parkin、β-actin 一抗(美國Santa Cruz 公司,批號sc-16315、sc-151144、sc-160532、sc-150861、 sc-14855、sc-160213、sc15433);辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗(美國Abbkine 公司,批號A21013);線粒體提取試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20150316)。 大鼠解剖板(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);垂直電泳和電轉(zhuǎn)印裝置(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司);臺式低速冷凍離心機(湖南凱達科學(xué)儀器有限公司);倒置顯微鏡(德國奧林巴斯);線粒體呼吸測定儀(英國漢莎儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備與評價方法

所有大鼠隨機分為5 組：對照組、假手術(shù)組、模型組、中藥組、AMPK 激動組。 模型組、中藥組、AMPK 激動組均采用冠狀動脈結(jié)扎法制備梗死后心力衰竭模型,模型制備過程中連接小動物呼吸機維持呼吸,心電監(jiān)護。 結(jié)扎左冠狀動脈后觀察心電圖,待結(jié)扎部位明顯缺血,Ⅱ?qū)?lián)ST 段持續(xù)抬高時,說明心肌梗死模型制備成功,此時可沿軟管空心剪除結(jié)扎線。 歸納心臟,依次縫合傷口,無菌敷料包扎,常規(guī)抗生素預(yù)防感染。 對照組不予以任何手術(shù),正常飼養(yǎng),假手術(shù)組僅給與開胸和剝離冠狀動脈的刺激,不結(jié)扎。 術(shù)后第2 天,心臟超聲心動圖測試左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF),≤50%者為梗死后心衰模型成功標(biāo)準。 剔除死亡鼠和模型制備失敗鼠,對照組、假手術(shù)組、模型組、中藥組、AMPK 激動組獲得的大鼠分別為20 只、19 只、16 只、17 只、17 只。

1.3.2 藥物干預(yù)方法

模型制備成功的大鼠進行藥物干預(yù),中藥組予以自制的溫陽益氣方干粉,取2 g 溶于100 mL 水,按每天0.10 mL/kg 大鼠灌胃。 AMPK 激動組在溫陽益氣方灌胃的基礎(chǔ)上肌肉注射EX229,用量為每天2.0 mg/kg,相當(dāng)于成人劑量的8 倍。 對照組、假手術(shù)組和模型組予以相同條件的溶劑或溶媒刺激,共干預(yù)4 周,每周稱重、測定LVEF。

1.3.3 取材方法和實驗分配

藥物干預(yù)完畢第2 天取材,各組隨機取5 只大鼠,取心臟,生理鹽水沖洗干凈,吸水紙吸除水分,測定心臟重量,計算心臟/體重比。 再隨機取5 只,取心肌組織,提取線粒體,測定用于線粒體活性。最終對照組、假手術(shù)組、模型組、中藥組、AMPK 激動組剩余數(shù)量為10 只、9 只、6 只、7 只、7 只,用于測定自噬標(biāo)志物及AMPK 的蛋白表達。

1.3.4 線粒體活性測定方法

取左心室心肌組織,生理鹽水沖洗干凈血液,置于EP 管,電動勻漿,采用線粒體提取試劑盒提取線粒體,操作步驟嚴格按照說明書要求進行。 所得線粒體采用線粒體呼吸儀測定state 3 的呼吸速率和state 4 的呼吸速率,計算線粒體呼吸控制比(respiratory control ratio,RCR)。 RCR = state 3 /state 4。

1.3.5 自噬標(biāo)志物和AMPK 表達的測定方法

取左心室心肌組織,采用總蛋白質(zhì)抽提試劑盒提取蛋白質(zhì),采用免疫蛋白印記(WB)實驗測定磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B(LC3B,含LC3II、LC3I 雙條帶)、磷酸酶基因誘導(dǎo)假定激酶1(PINK1)、Parkin、β-actin(內(nèi)參)的蛋白表達水平。 主要步驟：配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳液,預(yù)電泳清除膠內(nèi)雜質(zhì),每個電泳通道加入10 μg 蛋白,再90 V 電泳1 h。 將SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,1.0%的麗春紅染液觀察條帶分離度。 4%脫脂牛奶封閉90 min,抗體孵育,一抗孵育濃度為1 ∶1500 ～1 ∶2500,4℃搖床過夜;PBST 液清洗后二抗孵育,二抗孵育濃度為1 ∶2000～1 ∶2500,37℃搖床90 min。 ECL 顯色,暗室顯影,采用影像學(xué)分析軟件Image J 分析p-AMPK/AMPK、 LC3II/LC3I、 PINK1/β-actin 及Parkin/β-actin 的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0 進行分析,計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,本組符合正態(tài)分布,3 組之間的比較采用one-way ANOVA 法分析,有統(tǒng)計學(xué)差異者進一步采用LSD-t檢驗分析兩兩間的差異;P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備結(jié)果

不同時間點的大鼠體重和LVEF 如表1 和表2所示,各組大鼠基線值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。 T1 ～T2,與對照組相比,模型組LVEF 降低(P＜0.01),體重變化不明顯(P＞0.05);與模型組相比,其余各組變化不明顯(P＞0.05)。 T3 ～T5,與對照組相比,模型組體重和LVEF 均降低(P＜0.05 或P＜0.01);與模型組相比,中藥組體重和LVEF 均升高,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.2 心臟/體重比

與對照組比較,模型組心臟/體重比明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,中藥組和AMPK 激動組變化不大(P＞0.05),見表3。

2.3 心肌組織線粒體活性

與對照組相比,模型組state3 呼吸速率與RCR降低(P＜0.01);與模型組相比,中藥組state3 呼吸速率與RCR 升高(P＜0.05),其余各組變化不大(P＞0.05),見表4。

2.4 線粒體自噬標(biāo)志物

與對照組比較,模型組心肌組織p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、PINK1 及Parkin 蛋白表達水平升高(P ＜0.01);與模型組相比,中藥組p-AMPK/AMPK、LC3II/LC3I、PINK1 及Parkin 蛋白表達水平降低(P ＜0.01),其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見表5、圖1。

表1 各組大鼠不同時間段體重(±s,n=5,g)Table 1 The weight of rats in each groups at different time periods

表1 各組大鼠不同時間段體重(±s,n=5,g)Table 1 The weight of rats in each groups at different time periods

注： T0：基線值;T1：模型制備后、藥物干預(yù)前;T2：藥物干預(yù)1 周;T3：藥物干預(yù)2 周;T4：藥物干預(yù)3 周;T5：藥物干預(yù)4 周。 與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01。Note. T0, base line; T1, after model preparation and before drug intervention; T2,1 week after drug intervention; T3,2 weeks after drug intervention;T4, 3 weeks after drug intervention; T5,4 weeks after drug intervention. Compared with the control group,1) P＜0.05, 2) P＜0.01. Compared with the model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01.

組別Groups T0 T1 T2 T3 T4 T5對照組Control group 220.3±20.3 235.6±18.2 253.5±21.3 264.3±20.6 275.5±22.6 287.5±23.6假手術(shù)組Sham-operated group 221.2±22.5 232.6±16.5 250.2±21.3 263.3±21.2 275.0±21.3 285.6±21.5模型組Model group 222.5±19.6 233.0±18.2 240.3±20.3 249.5±20.611) 255.3±18.711) 261.2±19.111)中藥組TCM group 220.6±22.3 232.1±19.2 242.1±19.6 252.3±19.333) 262.3±19.233) 271.3±18.233)AMPK 激動組AMPK agonist group 222.3±19.2 233.6±19.2 241.3±21.3 247.2±19.3 254.6±20.3 258.6±20.1

表2 各組大鼠不同時間段LVEF(±s,n=5,%)Table 2 The LVEF of rats in each groups at different time periods

表2 各組大鼠不同時間段LVEF(±s,n=5,%)Table 2 The LVEF of rats in each groups at different time periods

注： T0：基線值;T1：模型制備后、藥物干預(yù)前;T2：藥物干預(yù)1 周;T3：藥物干預(yù)2 周;T4：藥物干預(yù)3 周;T5：藥物干預(yù)4 周。 與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01。Note. T0, base line; T1, after model preparation and before drug intervention; T2,1 week after drug intervention; T3,2 weeks after drug intervention;T4, 3 weeks after drug intervention; T5, 4 weeks after drug intervention. Compared with the control group, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01. Compared with the model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01.

組別Groups T0 T1 T2 T3 T4 T5對照組Control group 72.3±6.2 73.1±5.6 72.5±7.0 73.2±6.2 71.6±6.8 73.8±6.5假手術(shù)組Sham-operated group 71.5±5.6 72.3±5.8 71.9±6.2 73.3±7.0 73.5±6.0 73.6±7.1模型組Model group 71.8±6.0 38.3±4.6 2) 39.6±5.6 2) 41.6±5.1 2) 41.6±5.5 2) 40.8±6.8 2)中藥組TCM group 72.6±6.3 39.2±5.0 41.3±6.8 48.2±6.2 4) 52.6±6.5 4) 53.6±6. 244)AMPK 激動組AMPK agonist group 72.3±7.2 37.9±6.9 39.2±6.7 40.1±5.6 40.8±7.1 41.2±7.0

表3 各組大鼠心臟/體重比(±s,n=5)Table 3 Heart/body weight ratio of the rats in each group

表3 各組大鼠心臟/體重比(±s,n=5)Table 3 Heart/body weight ratio of the rats in each group

注：與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01。Note. Compared with the control group, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01. Compared with the model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01.

組別Groups 心臟/體重比heart weight/body weight ratio (HW/BW)對照組images/BZ_47_639_2183_639_2185.pngControl group 0.344±0.045假手術(shù)組Sham-operated group 0.351±0.039模型組Model group 0.407±0.041 1)中藥組TCM group 0.375±0.039 AMPK 激動組AMPK agonist group 0.411±0.044 1)

表4 各組大鼠心肌組織線粒體活性比較(±s,n=5)Table 4 Comparison of mitochondrial activity in myocardial tissues of the rats in each group

表4 各組大鼠心肌組織線粒體活性比較(±s,n=5)Table 4 Comparison of mitochondrial activity in myocardial tissues of the rats in each group

注：與對照組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01。Note. Compared with the control group, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01. Compared with the model group, 3) P＜0.05, 4) P＜0.01.

組別Groups 狀態(tài)3 State3(nmol O2/(min·mg pro))狀態(tài)4 State4(nmol O2/(min·mg pro)) 呼吸控制比RCR對照組Control group 46.3±5.01 8.26±1.22 5.61±0.66假手術(shù)組Sham-operated group 45.2±4.03 8.35±1.07 5.41±0.57模型組Model group 34.5±4.222) 8.33±1.11 4.14±0.602)中藥組TCM group 40.6±4.09 3) 8.15±1.09 4.98±0.50 3)AMPK 激動組AMPK agonist group 34.4±3.852) 8.41±0.95 4.09±0.55

表5 各組大鼠心肌組織p-AMPK/AMPK 和線粒體自噬標(biāo)志物表達比較Table 5 Comparison of the expressions of p-AMPK/AMPK and mitochondrial autophagy markers in myocardial tissue of the rats in each group

圖1 心肌組織p-AMPK/AMPK 和線粒體自噬標(biāo)志物Western blot 圖Figure 1 Results of Western blotting of p-AMPK/AMPK and mitophagy markers in the rat myocardial tissues

3 討論

慢性充血性心力衰竭屬“胸痹”范疇,張仲景在《金匱要略》中將“胸痹”的病因病機概括未為“陽微陰弦”,主張治以散寒、宣痹和化濕。 至明清時期,有醫(yī)家認為胸痹的病機與血瘀有關(guān),提出以活血化瘀為主的治療方法。 現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認為,胸痹病機為本虛標(biāo)實,本虛有氣虛、陰虛、陽虛等,以氣虛最為常見,標(biāo)實有血瘀、氣滯、痰濁等,以血瘀最為顯著[4]。 本研究所用溫陽益氣方由附子、肉桂、紅參、黃芪四味中藥組成,其中附子味辛、甘,性大熱,可回陽救逆,補火助陽,散寒止痛,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,附子可增強心肌收縮力,擴張血管,改善血液循環(huán),其回陽救逆功能主要源于其強心、抗休克作用。肉桂味辛、甘,性大熱,有散寒止痛,溫通經(jīng)脈之效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實,肉桂具有擴血管和降壓的作用,可用于心腦血管疾病的日常保健。 紅參和黃芪均為補益良藥,其中紅參大補元氣、復(fù)脈固脫、益氣攝血,適用于各種虛勞之證,而黃芪益可補氣升陽,益氣固表,脫毒生肌,適用于各種氣衰血虛。 各方藥協(xié)同作用,行氣、活血、溫陽、補虛,可達標(biāo)本兼治之效。

目前已有學(xué)者從抗炎、抗纖維化、抗心肌細胞損傷與凋亡等方向揭示了益氣活血方治療梗死后心衰的機制[5-7]。 細胞自噬是指細胞吞噬并降解自身細胞器及大分子蛋白質(zhì)的一種機制,是細胞回收利用胞內(nèi)成分,完成物質(zhì)轉(zhuǎn)運和更新的重要途徑[8]。 線粒體是真核生物合成ATP 的主要場所,細胞ATP 不足可促進AMPK 磷酸化,進而抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein,mTOR)促進細胞自噬,AMPK 是介導(dǎo)線粒體自噬的關(guān)鍵分子之一[9]。 心肌組織屬于線粒體富集組織,能量代謝活躍,在心衰的病理進程中,反復(fù)的缺血缺氧性損傷和缺血再灌注損傷極易破壞心肌細胞線粒體,目前研究已證實[10-11],AMPK 介導(dǎo)的線粒體自噬是梗死后心衰病理機制的重要組成部分。

本研究采用左冠狀動脈結(jié)扎的方法制備梗死后心衰大鼠模型,模型制備后,大鼠體重增長減慢,心臟重量增加,整體心臟/體重比有所升高。 國內(nèi)學(xué)者張世田等[12]指出,梗死后心力衰竭大鼠心臟體積增大,非梗死區(qū)心肌肥厚,前壁變薄,心室內(nèi)壁出現(xiàn)不均勻增生,偶見壁瘤。 本研究在模型制備后4周測量心臟/體重比,發(fā)現(xiàn)在模型制備4 周時,大鼠心臟體積已有增大趨勢。 中藥干預(yù)后,大鼠LVEF和體重有所升高,心臟/體重比降低,初步證實溫陽益氣方對緩解大鼠心室重構(gòu)和提高心肌功能有積極作用。 進一步研究發(fā)現(xiàn),溫陽益氣方的這一作用可被AMPK 激動劑所拮抗,說明其藥理機制可能與AMPK 有關(guān)。

為觀察溫陽益氣方的藥理作用是否與AMPK以及AMPK 介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān),研究對心肌組織的線粒體活性、p-AMPK/AMPK 蛋白表達、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3II/LC3I、PINK1、Parkin 蛋白表達均做了測定。 從線粒體活性的測定結(jié)果來看,模型組大鼠的線粒體呼吸功能減弱,溫陽益氣方可改善線粒體功能,且其作用可被AMPK 激動劑拮抗。 之所以測定p-AMPK/AMPK 的蛋白表達比,是因為p-AMPK 是AMPK 的主要活性形式,這一比值可代表AMPK 的活化程度[13],AMPK 激動劑也正是通過促進AMPK來發(fā)揮作用。 LC3 是細胞自噬的經(jīng)典標(biāo)志物,其中LC3II 為胞漿型,不具有自噬活性,而LC3I 為膜型,是自噬激活的標(biāo)志,LC3II/LC3I 是目前公認的較成熟的自噬標(biāo)志物,在心力衰竭、冠狀動脈粥樣硬化、心肌病中,均發(fā)現(xiàn)了LC3II/LC3I 的異常表達[14-15]。有學(xué)者指出,過高的LC3II/LC3I 表達水平與缺血組織再灌注損傷程度密切相關(guān),可作為衡量患者預(yù)后的一個重要指標(biāo)[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)梗死后心衰大鼠的心肌組織p-AMPK/AMPK 和LC3II/LC3I 表達同時升高,支持AMPK 介導(dǎo)的細胞自噬參與梗死后心衰病理機制這一觀點。

考慮到LC3II/LC3I 不是線粒體自噬的特異性標(biāo)志物,研究對PINK1 與Parkin 也做了測定。 線粒體自噬與其他細胞自噬類似,受到多種外膜受體的的調(diào)控,包括BNIP3、NIX、FUNDC1、PINK1 等,目前研究較成熟的是PINK1[17]。 PINK1 介導(dǎo)的線粒體自噬主要用于清除受損線粒體,正常線粒體外膜PINK1 可被跨膜轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部進行降解,含量極低[18]。 Parkin 是一種E3 泛素酶,主要存在于細胞漿中。 當(dāng)線粒體受損后,PINK1 聚集于外膜,募集parkin 而啟動線粒體自噬[19]。 本研究結(jié)果證實PINK1 與Parkin 的表達水平與LC3II/LC3I 一致,在模型組中顯著升高,中藥干預(yù)后得到降低,且中藥干預(yù)效果能被AMPK 激動劑所阻斷。 證實AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬可能是溫陽益氣方發(fā)揮藥理作用的重要環(huán)節(jié)。

綜上所述,溫陽、益氣方藥能夠改善梗死后心衰大鼠的心肌功能,其作用機制可能與抑制AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)。