于秀石,朱 佳,魏麗麗,馬克濤,司軍強,張忠雙,3?,田俊杰,羅 淑,魯廣森

(1.石河子大學醫(yī)學院,新疆 石河子 832000; 2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,烏魯木齊 830000;3.石河子大學新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

新生兒缺氧性肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension, HPH)是常見的威脅新生兒生命的急危重癥,疾病早期表現(xiàn)為肺血管痙攣,若及時發(fā)現(xiàn)并進行治療則可抑制血管痙攣,否則疾病發(fā)展到晚期則表現(xiàn)為肺血管重塑,發(fā)生不可逆的組織變化,此時期救治困難、死亡率高[1-2]。 目前其發(fā)病機制尚不清楚,已知血管舒縮因子的平衡失調(diào)在發(fā)病過程中起了重要作用[3-4]。 在HPH 的發(fā)病機制研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)和內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)的上游調(diào)節(jié)因子,參與HPH 的發(fā)生與發(fā)展[5]。miR-155 屬于小分子RNA,能通過與靶基因3’或5’非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)的結(jié)合,調(diào)控靶基因的表達,參與機體的各種生物調(diào)控過程,如miR-155 在抑郁癥患者的血漿中的表達與多種炎癥因子相關(guān)。 胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)能有效促進外周神經(jīng)再生,具有非選擇性神經(jīng)營養(yǎng)作用,已有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦室內(nèi)給予IGF-1,明顯減輕腦損傷區(qū)的神經(jīng)元缺失[6]。 在研究對HPH 的機制時,IGF-1 上調(diào)miR-155 表達的作用非常重要,但miR-155 在肺損傷中的作用鮮有報道[7];且國內(nèi)尚無新生兒HPH 發(fā)生與IGF-1 相關(guān)的研究。 故而本研究通過建立HPH 新生大鼠模型,以尼莫地平為工具藥,探索在HPH 發(fā)病過程中,IGF-1 的作用機制,HIF-1α 和ET-1 的生理功能,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar 大鼠180 只,雌雄不限,日齡3 ～5 d (大鼠新生兒期),體質(zhì)量(20 ± 5) g,購自海軍軍醫(yī)大學動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號[SCXK(滬)2019-0009]。 依據(jù)應(yīng)用實驗動物的3R 原則給予適當關(guān)照。 飼養(yǎng)及無菌手術(shù)在復旦大學醫(yī)學院實驗動物科學部屏障動物實驗設(shè)施進行[SYXK(滬)2019-0026],置于全自動調(diào)節(jié)低壓艙,飼養(yǎng)條件：室溫21℃～25℃,相對濕度50%～65%,光暗循環(huán)12 h/12 h,自由飲水攝食。 實驗動物福利倫理審查號：2019012304。

1.2 主要試劑與儀器

尼莫地平(國藥準字H43020645,規(guī)格：每片30 mg,湖南百草制藥有限公司);鼠源性單克隆抗體(Anti-β-actin)(美國Amgen 公司);ELISA 試劑盒(美國R&D 公司);BCA 蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit)(美國BioVision 公司);TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 試劑盒(美國ABI 公司);Gel-Doc 凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司);Leica Qwin 圖像分析系統(tǒng)(德國Leica 公司); NanoDrop 2000 蛋白/核酸分析儀(美國ThermoFisher 公司);高速離心機(美國Beckman 公司);LightCycler480 高通量實時熒光定量PCR 儀(美國羅氏公司);TRIzol 裂解液(美國Invitrogen 公司)和RNase-free 水(美國ThermoFisher 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

新生大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周,隨機分成3 組：模型組、給藥組及空白對照組。 將模型組和給藥組新生大鼠置于自制全自動調(diào)節(jié)常壓低氧艙內(nèi)(大氣壓約50 kPa,氧濃度10%),制造間斷性低氧環(huán)境,以1.5 L/min 的速度輸入含10%的氮氧混合氣,予以氧濃度儀監(jiān)測,維持氧濃度在9.5%～10.5%范圍內(nèi),控制二氧化碳濃度小于0.5%。 通過放置小風扇維持低氧艙倉內(nèi)氣體均勻,通過減壓閥和電磁閥調(diào)節(jié)艙內(nèi)壓力,予以無水氯化鈣、鈉石灰吸收箱內(nèi)的水蒸氣與二氧化碳。 晝/夜為12/12,每天缺氧8 h,連續(xù)2 周。 分別于缺氧2、4、8、12 d 檢測肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP),mPAP≥6.5 pg/mL,且具有較強時間依賴性,則證明成功建立HPH 大鼠模型[8]。 缺氧同時給藥,其中給藥組每天灌胃給予3 mg/kg 尼莫地平。 空白對照組除不低氧,即大氣壓約50 kPa,氧濃度10%,其余條件相同,兩組大鼠放于同一房間以相同飲食飼養(yǎng),模型組及空白對照組每天灌胃給予生理鹽水。分別于缺氧2、4、8、12 d 依照隨機數(shù)字表法抽取模型組、給藥組及空白對照組大鼠各10 只進行相關(guān)檢測指標的監(jiān)測。

1.3.2 mPAP 檢測

各組大鼠在被觀測時間點經(jīng)氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉后,固定實驗大鼠,消毒頸、胸部皮膚,行氣管插管,給予機械通氣,潮氣量：2 ～3 mL/min,監(jiān)測新生大鼠尾部血氧飽和度(pulse oxygen saturation,SpOb),使其維持在(90 ± 5)%。 開胸,朝著血流的反方向?qū)澬晤^皮針一端緩慢扎進肺動脈根部,頭皮針另一端通過壓力傳感器連接生理通道記錄儀。對肺動脈壓力曲線進行記錄。

1.3.3 肺損傷組織病理形態(tài)學觀察

于缺氧12 d 給藥后2 h,處死大鼠,取肺部組織,4%甲醛固定,脫水進行石蠟包埋,4 μm 進行組織切片,二甲苯脫臘,蘇木精染,伊紅乙醇染色,二甲苯處理,中性樹脂進行封膠固定,烘箱過夜處理,光鏡下觀察肺組織切片病理學變化。

1.3.4 Western blot 法檢測HIF-1α 和ET-1 在肺組織的表達

取“1.3.2”項下大鼠肺部組織,提取總蛋白,蛋白變性緩沖液變性,在硝酸纖維素膜上放置12.5%SDS-PAGE 膠轉(zhuǎn)膜后,3% BSA 4℃封閉過夜,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,分別摻入HIF-1α 和ET-1單克隆抗體(1 ∶500),在室溫下孵化45 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜。 二抗孵育,摻入HRP 標記的二抗(1 ∶1000),室溫孵化30 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,ECL 發(fā)光并成像,以β-actin 作為內(nèi)參,檢測HIF-1α 各組的相對表達,檢測肺部組織中的ET-1 蛋白的相對表達量。 采用顯微成像系統(tǒng)進行拍照,并對圖片使用Image Pro Plus 6.0 進行處理分析,將染色陽性顆粒的灰度單位轉(zhuǎn)換為吸光單位,并測量其密度(optical density,OD)值,以此作為其陽性表達的半定量。

1.3.5 ELISA 法檢測血清中HIF-1α 與ET-1 的表達

各組大鼠于觀察時間點采靜脈血0.5～1.0 mL,3000 r/min 離心15 min,提取上清液,置離心管置于-20℃冰箱備用。 使用ELISA 試劑盒,嚴格按照說明書操作,計算血清HIF-1α 與ET-1 的含量。

1.3.6 定量PCR 檢測肺組織的miR-155 mRNA表達

取出大鼠肺部組織研磨,加入1 mL TRIzol 裂解液,室溫靜置5 min,加入200 μL 氯仿混勻,室溫放置10 min。 離心取上層,加入等體積異丙醇于RNase-free 的1.5 mL 離心管中,冰浴30 min,在4℃,12 000 r/min 離心15 min,得到RNA 沉淀,空氣干燥RNA。 加入50 μL RNase-free 的水溶解RNA;利用NanoDrop 測定總抽提RNA,置于-20℃,備用。根據(jù)TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription kit試劑盒操作說明書,cDNA 產(chǎn)物由抽提的RNA 體外反轉(zhuǎn)錄實驗得到;在16℃中孵化需要30 min;在42℃中孵化需要30 min;85℃加熱5 min,4℃保存。通過得到的cDNA 進行PCR 熒光定量檢測,在LightCycler480 儀器上操作,以U6 為內(nèi)參,miR-155的相對表達用ΔCT 來表示,95℃,預變性10 min,95℃15 s,60℃30 s,70℃30 s,共40 個擴增周期,ΔCT=CTU6-CTmiR-155計算miR-155 mRNA 的相對表達,引物信息見表1。

1.4 統(tǒng)計學分析

本研究中數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 進行分析,采用單因素方差分析計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗,以P＜0.05 認為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般狀況比較

模型組大鼠反應(yīng)遲鈍,虛弱,體毛暗淡,蜷縮少動,精神萎靡,食量減少和體重下降等;空白對照組大鼠反應(yīng)敏捷,體毛光澤,飲食和體重正常;給藥組大鼠的反應(yīng)、體毛、飲食和體重介于空白對照組和模型組。

2.2 各組大鼠不同時間段mPAP 比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著降低(P＜0.05),見表2。

2.3 各組大鼠肺組織HE 染色

空白對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰可見,間質(zhì)無滲出,無炎癥細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)未發(fā)生水腫液與出血,肺泡壁完整;模型組肺微血管擴張充血,雙肺體積增大,明顯肺水腫,大量紅細胞與液體從肺泡腔及肺泡隔內(nèi)滲出,可見浸潤的炎癥細胞,偶然形成透明膜,大小各異的肺泡,肺泡間隔明顯增厚;給藥組大鼠其肺組織肺泡腔滲出、出血,毛細血管擴張開并充血,較模型組炎癥細胞浸潤明顯減輕,見圖1。

2.4 不同時間段各組大鼠血清中HIF-1α 與ET-1水平比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧2 d、4 d、8 d 和12 d 的HIF-1α 和ET-1 均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的HIF-1α 和ET-1均顯著降低(P＜0.05),見表3 和表4。

2.5 各組大鼠肺組織ET-1 蛋白表達檢測

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α 和ET-1 蛋白表達均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α和ET-1 蛋白表達均顯著降低(P＜0.05),見圖2 和表5。

表1 各引物序列信息Table 1 Primer sequence information

表2 各組大鼠不同時間段mPAP 比較(n=10)Table 2 Comparison of mPAP in the rats of different groups at different time of treatment (n=10)

圖1 各組大鼠肺組織的病理學改變Figure 1 Pathological changes in the lung tissues of rats in the three groups

表3 不同時間段各組大鼠血清中HIF-1α 水平比較(n=10)Table 3 Comparison of the serum HIF-1α levels at different times of rats in the three groups (n=10)

表4 不同時間段各組大鼠血清中ET-1 水平比較(n=10)Table 4 Comparison of serum ET-1 levels at different times of rats in the three groups (n=10)

圖2 Western blot 檢測大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達Figure 2 Western blot detection of the ET-1 expression in the rat lung tissues

表5 Western blot 檢測大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達(n=10)Table 5 Western blot detection of ET-1 expression in lung tissues of rats in the three groups (n=10)

2.6 各組大鼠肺組織miR-155 表達比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達顯著降低(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達顯著增高(P＜0.05)。 進一步從TargetScan 網(wǎng)站對miR-155 的靶基因進行預測發(fā)現(xiàn),其與HIF-1α 的5’UTR 配對互補,說明miR-155 可能是通過靶向結(jié)合HIF-1α 3’ UTR 調(diào)控其在肺組織中的表達水平。 見圖3 和表6。

圖3 各組大鼠肺組織miR-155 表達比較(n=10)Figure 3 Comparison of expression of microRNA-155 in lung tissue of rats in the three groups (n=10)

3 討論

3.1 HPH 的發(fā)病機制及病理生理

HPH 的相關(guān)研究認為肺動脈高壓的起始環(huán)節(jié)為缺氧所致肺微小動脈內(nèi)皮損傷,細胞因子與血管活性物質(zhì)產(chǎn)生及異常釋放的原因為血管內(nèi)皮受損導致功能失調(diào)引起[9]。 作用于血管平滑肌的血管舒縮因子平衡失調(diào),出現(xiàn)肺血管收縮為早期表現(xiàn),出現(xiàn)HPH,肺血管重建及肺血管壁病理改變?yōu)镠PH后期表現(xiàn)[10]。 其中越來越受到關(guān)注的為HIF-1α 的作用[11],生理活性由α 亞基的表達和活性決定的氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子,是在缺氧條件下誘導產(chǎn)生的、在體內(nèi)許多細胞中廣泛存在的。 HIF-1α 是介導機體對缺氧發(fā)生基因表達重新調(diào)整、肺血管收縮、肺血管重塑形成的中心環(huán)節(jié),在HPH 的發(fā)生過程中起著非常重要的作用[12]。 有研究表明缺氧早期低氧刺激肺組織產(chǎn)生大量HIF-1α,由于缺氧耐受效應(yīng)使得肺組織HIF-1α[13]表達隨著缺氧時間延長不再明顯提高。 本研究表明,在HPH 大鼠模型中,早期缺氧刺激能顯著提高HIF-1α 的表達,而在缺氧后8 d和12 d 雖然也有增加,但HIF-1α 的表達相比于前期無顯著變化。

ET-1 是內(nèi)源性血管收縮因子,肺部是ET-1 作用和代謝的最重要臟器[14]。 ET-1 可能是促使肺血管強烈收縮導致肺動脈高壓發(fā)生過程中的一個重要因素[15]。 本次研究結(jié)果表明,在模型組新生大鼠缺氧2 d 起血清ET-1 即明顯增高,并持續(xù)至12 d,同時在模型組大鼠肺組織中ET-1 蛋白也存在著顯著高表達。 其原因可能為：在缺氧早期血管內(nèi)皮細胞在低氧刺激下產(chǎn)生大量HIF-1α,HIF-1α 誘導下游靶基因ET-1 高表達。 肺血管內(nèi)皮細胞膜上ET-B受體與通過自分泌途徑異常升高的ET-1 相結(jié)合,生成大量氧自由基,對肺動脈高壓損傷程度加重與肺血管內(nèi)皮細胞本身的脂質(zhì)造成過氧化損害[16]。?

表6 miR-155 靶基因預測結(jié)果Table 6 Predictive results of target genes for microRNA-155

3.2 IGF-1 上調(diào)miR-155 表達對HPH 的作用

IGF-1 作為體內(nèi)重要的生長因子,對細胞的增殖、分化、凋亡及機體的生長發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用[17-18];已有相關(guān)研究報道稱IGF-1 可防治高氧肺損傷[19-20]。 在對HPH 大鼠模型進行現(xiàn)非侵入性鼻腔滴入IGF-1 后發(fā)現(xiàn),肺部組織損傷明顯降低,說明入IGF-1 對大鼠低氧肺動脈高壓肺組織損傷有保護作用。 通過檢測給藥組大鼠肺組織HIF-1α 以及ET-1 的表達發(fā)現(xiàn),其在肺組織中的表達水平得到了明顯的抑制,表明IGF-1 可能通過作用于HIF-1α,進而抑制ET-1 的表達,發(fā)揮對肺組織的保護作用[21]。

IGF-1R mRNA 可在大鼠肺小動脈壁上正常表達。 IGF-1 可特異結(jié)合細胞膜ICG-1R,傳導其刺激增殖信號,引發(fā)細胞增殖、細胞分化等效應(yīng)。 ICG-1R 受激活后可影響大部分細胞的增殖和轉(zhuǎn)化過程,同時抑制細胞凋亡[22]。 本次研究表明,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 平均水平為均顯著高于空白對照組mPAP 對應(yīng)時間的平均水平,各時間的差異均具有統(tǒng)計學意義,提示經(jīng)低氧環(huán)境培養(yǎng)后,大鼠可產(chǎn)生低氧性肺血管重建和缺氧性肺動脈高壓。 Dogansen 等的研究[23]表明,肺動脈高壓的大鼠中,肺小動脈壁miR-155 水平明顯減少。 分析原因,在低氧性肺血管重建過程中, IGF-1R 不僅擔任受體角色,而且可引導肺血管平滑肌細胞從收縮表型轉(zhuǎn)化成合成表型,促進細胞增殖。 而血管壁結(jié)構(gòu)構(gòu)成與細胞增殖及凋亡相關(guān)。 綜上,IGF-1R 具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用,因此有利于血管壁結(jié)構(gòu)重建,而miR-155 是IGF-1R mRNA 中重要的抑制因子[24]。 因此,低氧條件時,肺小動脈壁miR-155 水平的降低與低氧性肺血管重建具有重要的關(guān)聯(lián),適當提升其水平有利于改善HPH 病情[25]。

在分子水平上采用定量PCR 檢測肺組織中miR-155 的表達發(fā)現(xiàn),與空白對照組大鼠比,模型組大鼠肺部組織中miR-155 表達明顯下降,差異具有顯著性。 與模型組大鼠比,IGF-1 給藥后大鼠肺組織中miR-155 表達的平均水平則明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。 對其靶基因進行預測分析發(fā)現(xiàn),其可能通過靶向結(jié)合HIF-1α 5’UTR,調(diào)控其在肺組織中的表達。

低氧作為始動因素通過誘導HIF-1α 及其ET-1的表達,IGF-1R 具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用,miR-155 對IGF-1R 的抑制作用減弱,導致肺血管收縮與增生異常,進而導致HPH 肺組織損傷。 IGF-1 可顯著上調(diào)肺組織中miR-155 的表達,降低IGF-1R 的細胞增殖作用并促進細胞凋亡,一定程度上保護肺組織損傷的發(fā)生,對臨床治療缺氧性肺動脈高壓引發(fā)的肺損傷提供理論依據(jù)。