苗玉發(fā),康慧君,王曉姝,李路路,曲 哲,楊艷偉,張河戰(zhàn),李 波

(中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100176)

酮康唑(ketoconazole,KTZ)化學(xué)名稱為1-乙酰基-4{4-[2-(2,4-二氯苯基)-2(1H-咪唑-1-甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲氧基]苯基}-哌嗪,是一種合成的咪唑類抗真菌劑,對(duì)皮膚真菌、酵母菌、雙相真菌和真菌綱具有抑菌和殺菌活性。 作用機(jī)制為抑制真菌細(xì)胞膜麥角甾醇的生物合成并改變細(xì)胞膜脂類化合物的組成,影響細(xì)胞膜的通透性,抑制其生長(zhǎng)[1]。 KTZ 在胃內(nèi)溶解后易被吸收,其吸收后在體內(nèi)可廣泛分布到關(guān)節(jié)液、唾液、膽汁、尿液、乳汁、皮膚軟組織和糞便中等。

2011 年8 月31 日,在第40 期《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》中,200 mg KTZ 口服片劑被提示有嚴(yán)重肝毒性,因?yàn)榕R床上KTZ 已經(jīng)引起患者嚴(yán)重的肝損傷。

四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)是一種無色的液體,在動(dòng)物體內(nèi)能夠引起肝細(xì)胞變性壞死,可以模擬人肝病變模式,而且個(gè)體差異較小,所以在研究中常用作肝細(xì)胞損傷模型的造模劑[2]。

目前,臨床上預(yù)測(cè)肝損傷的常用指標(biāo)是谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT),雖然其具有一定的特異性,但靈敏度存在不足,尋找靈敏度和特異性都較好的生物標(biāo)志物一直是肝毒性研究的方向。本研究使用KTZ 和CCl4在Wistar 雄性大鼠中構(gòu)建肝細(xì)胞損傷模型,以肝病理改變和ALT 升高兩者都具備作為判斷建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。 對(duì)于建模成功的動(dòng)物,制備外周血清,采用雙向電泳技術(shù)篩選血清差異蛋白,再采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)類型,尋找潛在的肝細(xì)胞損傷生物標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7 周齡Wistar 雄性大鼠96 只,SPF 級(jí),160 ～200 g,從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京) 2016-0006]購買。 在中檢院安全評(píng)價(jià)研究所SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)[SYXK(京) 2016-0045] 中飼養(yǎng),每籠3 只。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)號(hào)：IACUC2014026。 實(shí)驗(yàn)者在研究過程中遵循"3R"原則,并給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)有的福利和關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

200 mg KTZ 片劑(西安楊森制藥公司);泡漲液(Bio-Rad 公司);蛋白質(zhì)Marker(中科院上海生物化學(xué)研究所);血清蛋白提取試劑盒(美國(guó)Epigentek公司);CCl4(北京化工廠);ALT 檢測(cè)試劑盒(日本和光株式會(huì)社);蘇木素-伊紅染色液(北京世濟(jì)合力生物科技有限公司)。 5810R 型離心機(jī)(Eppendorf 公司);7180 型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司);Tissue-Tek VIP6 日本櫻花全封閉組織脫水機(jī)(日本櫻花精機(jī)株式會(huì)社);分析天平(島津公司);等電聚焦電泳儀(Amersham 公司);SDSPAGE 電泳儀(Amersham 公司);凝膠掃描儀(GE healthcare 公司);分光光度計(jì)(島津公司);質(zhì)譜儀(Bruker 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物配制、給藥劑量、分組及解剖

將KTZ 片劑溶于水混勻配制成40 mg/mL 的混懸溶液,冷藏備用;CCl4用精制花生油配制成30%的溶液,使用當(dāng)天配制。 KTZ 給藥劑量為225 mg/kg,CCl4(V/V：30%)給藥體積為10 mL/kg。 實(shí)驗(yàn)設(shè)置KTZ 組、CCl4組和對(duì)照組。 給藥方式為灌胃給藥。 KTZ 組每天給藥1 次,共給藥2 次。 第2 次給藥結(jié)束后4、24、48 和72 h 分別解剖8 只動(dòng)物,制備血清,肝做病理切片。 CCl4組給藥1 次后4、24、48和72 h 分別解剖8 只動(dòng)物,制備血清,肝做病理切片。 對(duì)照組給予等量生理鹽水1 次后4、24、48 和72 h 分別解剖8 只動(dòng)物,制備血清,肝做病理切片。動(dòng)物解剖前16 ～18 h 開始禁食,正常飲水。

1.3.2 外周血清和病理切片制作

動(dòng)物麻醉后,從腹腔大靜脈取2 ～3 mL 全血,靜置約40 min 后,3000 r/min 條件下離心制備血清。 肝取材后放入10%甲醛固定液中固定24 h,置換新鮮固定液繼續(xù)固定24 h。 然后將肝組織修塊切成1 cm×1 cm×0.2 cm 大小的組織塊,裝入包埋盒中,經(jīng)過脫水,透明后包埋成蠟塊,并制作切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,鏡下觀察肝組織病理改變[3-4]。

1.3.3 血清蛋白提取

收集對(duì)照組血清,以及KTZ 組和CCl4組給藥后ALT 顯著升高且肝發(fā)生病理變化的24 h 時(shí)間點(diǎn)的血清,每組動(dòng)物的血清按組別分別進(jìn)行混合后,按照試劑盒說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。

1.3.4 雙向凝膠電泳

將KTZ 組、對(duì)照組和CCl4組各1.0 mg 蛋白質(zhì)加入重泡漲液中,使總體積為450 μL,每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)樣。 用等電聚焦儀進(jìn)行第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳：12 h 重泡漲;250 V,0.5 h;1000 V,0.5 h ;8000 V,9 h。 結(jié)束后,膠片經(jīng)平衡后進(jìn)行第二向垂直平板SDS-PAGE 電泳[5-7]。

1.3.5 圖像分析

將膠塊在考馬斯亮藍(lán)中染色,然后脫色至背景清晰。 拍攝后用ImageMaster 7.0 軟件進(jìn)行分析,與對(duì)照組相比,KTZ 組和CCl4組同時(shí)具備大于1.5 倍的差異點(diǎn)作為目的蛋白。

1.3.6 酶解及質(zhì)譜分析

將目的蛋白質(zhì)點(diǎn)放入試管中,37℃超純水中浸泡30 min,在脫色液中震蕩脫色30 min,反復(fù)2 ～3遍,直至膠塊和脫色液變無色;在100% ACN 中浸泡15 min,真空條件下離心干燥5 min;加入15 μL Trypsin 酶液,冷藏45 min,10 h 空氣浴,然后將反應(yīng)液收集試管中;加入50 μL 33% ACN 和0.1% TFA(三氟乙酸),萃取30 min,離心后吸取上清放置試管中。 用含66% ACN 和0.1% TFA,和含100%ACN 和0.1% TFA 的萃取液再萃取一次。 將反應(yīng)液和3 次萃取液混合,凍干至5 ～6 μL,冷藏備用。 質(zhì)譜分析時(shí)取樣品0.5 μL 點(diǎn)靶,烤干,重復(fù)2 次,點(diǎn)基質(zhì)0.3 μL,干燥后在質(zhì)譜儀上分析[8]。

1.3.7 數(shù)據(jù)庫檢索

在NCBInr 數(shù)據(jù)庫中檢索蛋白質(zhì),參數(shù)設(shè)置：種類為Mus musculus;酶為胰蛋白酶,允許1 個(gè)漏切位點(diǎn);肽質(zhì)量容忍差異為0.2;MS/MS 容忍差異為0.3。使用UniProt 提供的數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)功能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ALT 檢測(cè)結(jié)果

KTZ 給藥2 次后,給藥結(jié)束后24 h,與對(duì)照組相比,ALT 值升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。給藥結(jié)束后4 h,48 h 和72 h,與對(duì)照組相比,ALT 的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 CCl4給藥后4 h,與對(duì)照組相比,ALT 值升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05),24 h 時(shí)達(dá)到峰值,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 48 h 開始下降,72 h 顯著下降,但仍高于對(duì)照組水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),結(jié)果見表1。

2.2 病理檢查結(jié)果

KTZ 給藥結(jié)束后24 h,病理結(jié)果顯示肝輕度肝細(xì)胞泡沫樣變性,見圖1A,箭頭所指為泡沫樣變性。CCl4給藥結(jié)束后24 h,肝中央靜脈周圍中度肝細(xì)胞氣球樣變和肝細(xì)胞壞死,見圖1C,細(xì)箭頭所指為氣球樣變,粗箭頭所指為肝細(xì)胞壞死。 圖1B 顯示的對(duì)照組動(dòng)物肝病理圖片。

2.3 雙向凝膠電泳結(jié)果

選取KTZ 組和CCl4組給藥結(jié)束后24 h 制備的血清,進(jìn)行雙向蛋白電泳。 與對(duì)照組相比,KTZ 組和CCl4組共獲得4 個(gè)相同的蛋白差異點(diǎn)。 含量增加的有點(diǎn)37,見圖2;含量減少的有點(diǎn)27、93 和195,見圖3(以點(diǎn)195 為代表)。

2.4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

通過查詢UniProt 數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞毒性相關(guān)的上調(diào)蛋白1 個(gè),下調(diào)蛋白3 個(gè),結(jié)果見表2。

表1 各組ALT 檢測(cè)結(jié)果(±s,n=8,IU/L)Table 1 Results of ALT analysis

表1 各組ALT 檢測(cè)結(jié)果(±s,n=8,IU/L)Table 1 Results of ALT analysis

注：與對(duì)照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note. Compared with the control group,?P＜0.05,??P＜0.01.

分組Groups對(duì)照組Control group KTZ 組KTZ group CCl4 組CCl4 group 4 h 33±7 42±13 80±24?24 h 32±8 140±106? 4170±1933??48 h 32±4 56±35 2994±843??72 h 34±6 46±18 728±315??

圖1 肝組織病理改變的HE 染色圖Figure 1 Pathological changes of the rat liver tissues(HE staining)

3 討論

本研究中采用肝病理改變合并ALT 升高作為判斷肝細(xì)胞損傷的標(biāo)準(zhǔn),確保采集到的血清是肝細(xì)胞損傷發(fā)生時(shí)的血清,確保鑒定出的差異蛋白是肝細(xì)胞損傷發(fā)生時(shí)的差異蛋白。 KTZ 導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷,在臨床中具有非常明顯的個(gè)體差異,在動(dòng)物體內(nèi)也不例外。 前期探索研究中,發(fā)現(xiàn)雄性大鼠比雌性大鼠更容易誘導(dǎo)肝損傷模型,因此,本研究中只采用雄性大鼠進(jìn)行研究,雌性大鼠肝細(xì)胞損傷后的差異蛋白可以在以后實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探索研究。 探索實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),225 mg/kg KTZ 給藥1 次后,在2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h 和72 h 時(shí),ALT 都沒有出現(xiàn)升高。 連續(xù)給藥2 次后4 h,仍只有少數(shù)動(dòng)物的ALT升高,且無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 在24 h 時(shí),才出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性升高,這說明此劑量水平的KTZ 對(duì)大鼠肝細(xì)胞損傷的個(gè)體差異較大。 更高劑量的KTZ并沒有產(chǎn)生明顯的毒性劑量效應(yīng),所以本實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行更高劑量的肝毒性研究。 實(shí)驗(yàn)中CCl4給藥一次后2 h,ALT 未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性升高。 4 h 起,所有時(shí)間點(diǎn)ALT 都出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著性升高,48 h 達(dá)到峰值,72 h 開始下降,但仍顯著性高于對(duì)照組。 說明此劑量CCl4的肝細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于225 mg/kg 劑量的KTZ,且個(gè)體差異較小,是急性肝細(xì)胞損傷理想的誘導(dǎo)劑。 本研究中CCl4的劑量約為3 mL/kg,目的是通過高劑量造成肝細(xì)胞的急性變性壞死,然后研究肝損傷發(fā)生時(shí)外周血中的差異蛋白。 高劑量的CCl4還可以避免因動(dòng)物個(gè)體差異導(dǎo)致的造模失敗。 KTZ 組和CCl4組24 h 點(diǎn)采集到的發(fā)生明顯肝損傷時(shí)的外周血清分別用于雙向電泳,并與對(duì)照組血清比較,篩選出共同的差異性蛋白用于質(zhì)譜鑒定。

圖2 點(diǎn)37 的雙向凝膠電泳圖Figure 2 Two dimensional gel electrophoresis images of Match ID 37

表2 質(zhì)譜鑒定的差異蛋白質(zhì)Table 2 Differential proteins identified by LC MS/MS analysis

圖3 點(diǎn)195 的雙向凝膠電泳圖Figure 3 Two dimensional gel electrophoresis images of Match ID 195

雙向凝膠電泳是一種應(yīng)用了20 余年的成熟技術(shù),對(duì)蛋白質(zhì)組的分辨率最高、重復(fù)性最好。 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量不同,進(jìn)行兩次電泳將蛋白質(zhì)分離,一般能分辨到1000 ～3000 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。蛋白分離后需經(jīng)染色將蛋白顯示出來,常用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色和銀染。 熒光染色和同位素標(biāo)記也時(shí)常應(yīng)用。 銀染可檢測(cè)到2～5 ng 的蛋白,考馬斯亮藍(lán)染色可檢測(cè)到8～50 ng 的蛋白,因此,銀染較考馬斯亮藍(lán)染色敏感。 銀染雖然靈敏度高,但之后的質(zhì)譜鑒定兼容性欠佳。 考馬斯亮藍(lán)雖然靈敏度低,但其操作簡(jiǎn)單且與質(zhì)譜匹配度好,因而一直被廣泛應(yīng)用[9]。 本研究考慮到凝膠染色的靈敏度和質(zhì)譜兼容性問題,選擇了考馬斯亮藍(lán)染色。 這種染色方法的相對(duì)低靈敏度會(huì)導(dǎo)致一些低含量蛋白漏染,此外,多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色,因此,大多數(shù)差異性的糖蛋白也不能夠被識(shí)別出來。

ApoAI 是高密度脂蛋白( high - density lipoprotein,HDL)中的主要蛋白質(zhì),具有促進(jìn)膽固醇的代謝以及調(diào)節(jié)HDL 的代謝作用,臨床上HDL 水平的升高有助于推遲或阻止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。有研究表明冠心病患者血清中Apo AI 的水平較低,肝硬化患者血清中ApoAI 水平非常顯著性降低,肝硬化合并肝性腦病的患者血清中載脂蛋白AI、B 水平以及白蛋白水平也明顯降低[10-11]。 Lee 等[12]采用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)羊子宮腔液的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示羊在妊娠時(shí)ApoAI 增加明顯。

肝細(xì)胞急性損傷時(shí)肝細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被釋放入血,包括大量血紅蛋白。 游離的血紅蛋白具有氧化還原活性,能破壞氧化還原微環(huán)境,導(dǎo)致細(xì)胞組織毒性。 血紅蛋白結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白可以與血紅蛋白結(jié)合從而起到抗氧化作用。 此外,當(dāng)血紅蛋白結(jié)合蛋白和結(jié)合珠蛋白耗盡時(shí),游離的ApoAI 也可以作為抗氧化劑與血紅蛋白結(jié)合,是消除血紅蛋白氧化還原活性的又一有效途徑[13]。本研究中KTZ 和CCl4能導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞急性損傷,血紅蛋白釋放入血,為清除血紅蛋白的氧化還原活性,ApoAI 代償性增加,這可能是導(dǎo)致24 h 點(diǎn)血清中ApoAI 含量上調(diào)的原因,但具體的機(jī)制仍不清楚,仍需要進(jìn)一步研究各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ApoAI 的變化情況。

GSH-Px 是一種重要的過氧化物分解酶,可以保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受干擾和損害[14]。 血漿GSH-Px 構(gòu)成與胞漿GSH-Px 相同,由4 個(gè)相同的22×103 的亞基構(gòu)成的四聚體,廣泛存在于各個(gè)組織中。 GSH-Px 活性在妊娠期糖尿病孕婦血清中顯著降低,可作為妊娠期糖尿病預(yù)測(cè)診斷指標(biāo)之一[15]。有研究顯示低水平的硒和GSH-Px 可作為輔助診斷晚發(fā)型重度子癇前期的有效生物學(xué)指標(biāo)[16]。 此外,中藥肝毒性研究結(jié)果表明GSH-Px 含量降低與肝毒性發(fā)生相關(guān)性比較大,而且指標(biāo)靈敏性較強(qiáng)[17]。 本研究中肝損傷發(fā)生時(shí),血中的GSH-Px 催化血中的過氧化物轉(zhuǎn)化,消耗增加導(dǎo)致含量下調(diào),與臨床上肝毒性研究結(jié)果也相吻合。

Shore 于1973 年首先發(fā)現(xiàn)ApoE,Rall 等于1982年測(cè)出ApoE 的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。 人ApoE 是由299個(gè)氨基酸殘基組成,富含精氨酸,主要由肝合成。ApoE 存在于血漿乳糜微粒(chylomicron, CM)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)及其殘粒中[18]。 ApoE 是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受體和CM 殘粒受體的配體,它不僅參與脂蛋白代謝,還參與免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)組織再生。 有研究表明早期帕金森病患者和晚期帕金森病患者血漿中ApoE 蛋白水平均顯著低于對(duì)照組[19]。 本研究中ApoE 表達(dá)下調(diào),可能與大鼠肝細(xì)胞損傷后ApoE 合成減少,以及消耗增加相關(guān)。

大鼠VDBP 是主要由肝合成和分泌的單體酸性糖蛋白,分子量大約52×103～54×103,其mRNA 總長(zhǎng)為1700 個(gè)堿基。 VDBP 能與血液中維生素D 及其代謝產(chǎn)物25(OH)D 特異性結(jié)合,對(duì)甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有重要作用。 有研究表明,VDBP 還能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合,阻止肌動(dòng)蛋白的聚合。 此外,還發(fā)現(xiàn)VDBP 還能與B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞表面的某種膜蛋白結(jié)合,在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[20]。 有研究顯示,肝纖維化患者和肝癌患者的外周血中VDBP 含量降低,而且疾病越嚴(yán)重,VDBP 降低幅度就越大[21]。 本研究中大鼠血清VDBP 含量在肝細(xì)胞損傷發(fā)生后減少,可能與肝細(xì)胞合成VDBP 減少,維生素D 甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)消耗增加有關(guān)。 肝損傷發(fā)生后,機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)也會(huì)發(fā)生復(fù)雜變化,VDBP 也可能會(huì)參與免疫反應(yīng),多種累加效應(yīng)導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)血中VDBP 減少,但具體機(jī)制仍需繼續(xù)探索。

本研究鑒定出的4 種差異蛋白,可以作為肝細(xì)胞損傷的潛在生物標(biāo)志物,在不同的動(dòng)物肝細(xì)胞損傷模型中進(jìn)一步進(jìn)行靈敏度和特異性驗(yàn)證研究。