文 李 NIYOKWIZERA Isaac 劉步青 許 宙 陳茂龍 程云輝

(長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114)

免疫活性肽(Immunopeptides)能增強巨噬細胞吞噬功能、刺激淋巴細胞增殖并增強機體免疫力，以及提高機體抵御外界病原體感染的能力，部分免疫活性肽甚至參與機體的抗腫瘤作用[1-2]。

食源性蛋白質來源廣泛，食用安全性高。許多免疫活性肽本身以非活性狀態(tài)存在于食源性蛋白質中，其活性在被消化或水解后才能釋放出來。從食源性蛋白質的酶水解產物中所制備的免疫活性肽，能以完整肽的形式被腸道吸收或在腸道與受體結合發(fā)揮作用，目前能最有效獲得食源性免疫活性肽的水解酶主要有胰酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶等。近20年來，對食源性免疫活性肽研究的報道逐年增多，如牛奶、雞蛋、魚類、貝類和蛙類等動物來源的免疫活性肽，以及大豆、燕麥、小麥和大麥等植物來源的免疫活性肽等[3]。

鑒于天然免疫活性肽在生物體內含量較少，且分離提純成本高，對現(xiàn)有的食品加工副產物中蛋白質進行蛋白酶水解，并分離提純免疫活性肽不失為一條成本相對較低的途徑。試驗團隊曾對免疫活性肽的分類與常規(guī)分離技術[4]，以及活性肽與MHC分子結合能力的免疫信息學進行了綜述[5]。文章擬在此基礎上，對食源性免疫活性肽的分離策略及作用機制進行綜述，旨在為將來的研究提供新思路。

1 免疫與免疫活性肽

免疫系統(tǒng)分為先天免疫(天然免疫)和適應性免疫(獲得性免疫)。先天免疫是非特異性的，主要通過機體的天然屏障(如皮膚和黏膜)、生理學防御(低pH、溫度和化學介質)、細胞(如巨噬細胞、多形核白細胞、樹突狀細胞)和自然殺傷(NK)細胞)或炎癥因子(如細胞因子、干擾素、補體、防御素、白三烯、急性期蛋白質和前列腺素)提供第一道防御。適應性免疫對潛在危險的外來抗原具有高度特異性，可分為細胞免疫和抗體介導的體液免疫，而T淋巴細胞(T 細胞)和B淋巴細胞(B 細胞)是適應性免疫中最重要的細胞。體液免疫中B淋巴細胞可在與特異性抗原相互作用時產生抗體，抗體可與入侵的抗原結合并標記以供巨噬細胞破壞。細胞免疫由T淋巴細胞組成，T淋巴細胞可分泌免疫調節(jié)因子并介導與抗原呈遞細胞(APC)相互作用的細胞免疫應答。T淋巴細胞分為3個亞組，即細胞毒性T細胞(Tc細胞)、輔助T細胞(Th細胞)和調節(jié)T細胞(Treg細胞)。Tc細胞表面受體CD8+可識別內源性抗原與主要組織相容性復合體(MHC I)結合的復合物，并殺死癌癥細胞和感染病毒的細胞；而Th細胞表面標記物CD4+可識別與MHC II結合的外源性抗原復合物，Th細胞可分泌細胞因子，如干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素(Interleukin，IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL-25，并幫助激活B細胞、T細胞和其他免疫細胞(如巨噬細胞)參與免疫反應。Treg細胞負責抑制其他T細胞的免疫反應，通過保持自我耐受來預防自身免疫疾病[6]。

免疫活性肽指能調節(jié)免疫活性，參與免疫細胞信號傳遞物質的短肽。當外源免疫活性肽進入抗原呈遞細胞(APC)后，可與MHC II 結合[7]。MHC II可結合由10～18個氨基酸組成的短肽，所形成的復合物可被抗原的T細胞受體(TCR)識別，并呈遞給CD4+T細胞，最終促使CD4+T細胞參與免疫應答反應，如刺激淋巴細胞增殖、分化、成熟，分泌細胞因子及增強巨噬細胞吞噬功能等[8]。

2 食源性免疫活性肽及其篩選手段

2.1 常規(guī)分離策略

目前，有關食源性活性肽的免疫調控研究大多是利用蛋白質酶的水解產物組分，即肽的混合物，僅少數(shù)研究報道了精確的氨基酸序列。傳統(tǒng)的分離方法通常是以酶解產物的某種特定活性功能為考察指標(大多為體外)，基于蛋白酶解物的疏水性、帶電性、分子量等性質的差異[9-10]，結合膜分離、多種常壓色譜、高壓色譜以及離子交換色譜等分離技術[11-12]，從酶解物中分離肽組分進行體內或體外免疫試驗，結合質譜鑒定技術獲得食源性免疫活性肽[13]。Xu等[14]從大米加工副產物中提取蛋白質，經(jīng)胰酶水解、大孔樹脂、液相色譜等技術分離出不同的酶解組分，并以小鼠巨噬細胞增殖指數(shù)為考察指標，從大米蛋白酶解物中篩選出免疫活性最強的胰酶水解產物，并證明了部分大米蛋白質水解產物具有免疫活性。

2.2 基于計算科學預測的篩選策略

近年來，隨著免疫基因組學和生物信息學的不斷發(fā)展，免疫信息學也得到了長足發(fā)展。質譜鑒定、核磁共振、結構生物學及免疫信息學等研究技術的發(fā)展，為免疫活性肽篩選方法的不斷更新提供了可能。已知免疫細胞T細胞激活及發(fā)揮免疫作用的先決條件是MHC II和對應抗原肽之間緊密結合而形成的復合體，MHC II類分子頂部皆存在一個狹長裂縫，可以結合含有特定氨基酸基序組成的短肽；MHC II分子與外源肽識別的基序專一性決定其可識別一類帶有特定共同基序的肽段，使得MHC II分子與外源抗原肽的結合具有一定的包容性[15]。而MHC II分子結合肽和T細胞表位預測等免疫信息學相關的數(shù)據(jù)庫收集了大量與免疫相關的分子信息，可實現(xiàn)免費在線的數(shù)據(jù)查詢、分析和計算等[16]。研究者可根據(jù)免疫活性肽氨基酸序列信息、MHC II結構特點和MHC-多肽復合體三維構象指導免疫活性肽的篩選乃至設計。

目前已有的網(wǎng)上服務器可解決肽段的理化性質、三維結構及與MHC II 分子結合的可能性，并預測肽段與MHC II分子結合后，復合體的三維結構模擬和自由能計算。主要有：

(1) 數(shù)據(jù)庫SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm)，裝載有MHC II分子配體及多肽基序，包含人類和猿、牛、雞、鼠等動物的MHC II類配體和表位，有助于實現(xiàn)針對性地篩選免疫活性肽[17]。

(2) NetMHCIIpan3.2服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/)，可用來預測人和鼠免疫活性肽與MHC II分子結合的可能性和強度[18]。

(3) Innovagen Pepcalc.com服務器(https://pepcalc.com/)，可預測肽段的等電點、凈電荷、親水性分布以及水溶性。

(4) TOXINPRED服務器(http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)，可用于預測肽的毒性。

(5) 通過PepFold 3.0服務器(http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/)可對肽的三維(3D)結構進行預測[19]。

(6) PepFold 3.0所獲得的數(shù)據(jù)可繼續(xù)采用最佳模型3D Refine服務器(http://sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/)進行氫鍵結合的優(yōu)化和原子能量的最小化[20]。

(7) 通過RAMPAGE服務器(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/～rapper/rampage.php)可獲得肽段的Ramachandran圖并評價肽結構的質量。

(8) CLUSPRO 2.0服務器(https://cluspro.bu.edu/login.php)可用于模擬組裝肽和MHC II之間的復合體，并獲得復合體的3D模型；然后采用MMGBSA法模擬計算復合物的結合自由能ΔGmmgbsa值[21]。

多年來，各物種基因組和蛋白質組學研究已積累了大量的蛋白質氨基酸序列數(shù)據(jù)，而各種質譜技術及生物信息學的發(fā)展，為獲得食物蛋白酶解產物的氨基酸序列并進行信息學分析打下了基礎。此外，Dhanda等[22]開發(fā)了一種基于代表性或共識產生表位簇序列的新算法Cluster2.0(http://tools.iedb.org/cluster2/)，用來預測免疫活性肽與MHC II分子結合的表位，可用來分析所有免疫活性肽的共同基序，尋找免疫活性肽的序列規(guī)律，從而指導免疫活性肽的功能驗證實驗。利用現(xiàn)有的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫和免疫信息學數(shù)據(jù)庫，結合細胞免疫功能的試驗驗證，或許能分析出食源性免疫活性肽的氨基酸組成和序列規(guī)律。

3 食源性免疫活性肽的作用機制

3.1 食源性免疫活性肽對先天性免疫的影響

體外和體內試驗[23]發(fā)現(xiàn)，食源性免疫活性肽可影響局部腸道免疫效應及系統(tǒng)免疫效應，可通過影響腸道的上皮細胞排列，并由此誘導腸腔上皮細胞和免疫細胞間的交流。腸腔上皮細胞所形成的第一道防御層，可防御有害病原體及分子，且這些細胞被一層黏液覆蓋，形成內腔含量與人體之間的物理屏障。研究[24]發(fā)現(xiàn)，腸腔中的免疫活性肽能增強上皮細胞的屏障作用，并增強黏液分泌及清除病原體所需的抗微生物蛋白的產生。如健康小鼠食用蛋黃肽能增加離體上皮細胞中IL-6的產生，而IL-6在先天性免疫反應和適應性免疫反應中均起作用，說明免疫活性肽可能以此方式通過上皮細胞來影響免疫系統(tǒng)。

另外，淋巴集結(PP)是遍布小腸回腸區(qū)域的少量淋巴組織，也被稱為聚集的淋巴結節(jié)，主要作用為監(jiān)測腸道細菌種群并防止腸道中的病原細菌的生長，是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。Egusa等[25]研究了大豆蛋白水解肽在PP中的作用，并對喂食富含大豆蛋白水解復合物5周后的小鼠，進行PP衍生細胞的全基因組表達分析，發(fā)現(xiàn)與先天免疫和宿主防御有關的幾個基因被上調，其中Igh-4和Aqp8的上調會增強吞噬作用，而Dmbt1、Slpi和Mx1則與抗菌和抗病毒成分相關。

3.2 食源性免疫活性肽對適應性免疫的影響

食源性免疫活性肽并不直接與病原體相互作用，而是通過與提呈細胞內的MHC II分子結合后參與免疫調節(jié)作用，提高宿主防御病原體的能力[26]?？乖蔬f過程主要發(fā)生在腸系膜淋巴結(MLN)中。來自腸道PP及固有層的負載抗原的樹突狀細胞遷移至MLN后，激活T細胞和B細胞，根據(jù)不同抗原的性質引起免疫應答或通過Treg的形成誘導免疫耐受[27]。

食源性免疫活性肽不僅會影響局部的腸道免疫組織，也會影響全身其他的免疫組織，如脾臟、腹膜細胞以及血液等。小肽可穿過腸道屏障，進入血液，直接影響全身的免疫細胞。分別用酪蛋白與乳制品、牡蠣、鮭魚等制成的蛋白質水解物可增加小鼠巨噬細胞的離體吞噬能力，增強脾臟中NK細胞活性及離體脾細胞增殖能力等。研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚卵堿性蛋白酶水解肽可增加小鼠脾臟中的CD4+和CD8+細胞數(shù)量[28]，而鮭魚卵的水解產物可增加CD4+細胞數(shù)量[29]。同時，在血液中都檢測到Th1(含有IL-2和IFN-γ)和Th2(含有IL-4和-5)細胞因子，說明食源性免疫活性肽參與調控免疫細胞Th1和Th2的分化[29]。食源性免疫活性肽可影響B(tài)細胞反應的另一個重要證據(jù)是血液中抗體水平的升高，研究[28]發(fā)現(xiàn)食源性免疫活性肽不僅可能影響B(tài)細胞分化，還可誘導免疫細胞的類別轉換及抗體的產生。

目前，僅有很少的研究調查了食源性蛋白水解肽對人類血液中免疫參數(shù)的影響，Yimit等[30]發(fā)現(xiàn)單劑量大豆水解肽可改變白細胞數(shù)量，并導致粒細胞增加及血液中的CD11b+(巨噬細胞和/或樹突狀細胞)和CD56+細胞數(shù)目顯著升高(NK細胞)。在服食小麥麥麩蛋白水解肽6 d后，可觀察到體內NK細胞活性的增加[31]。這些研究僅檢測了少數(shù)免疫學參數(shù)，且受試樣本較少，因此食源性免疫活性肽對人體的作用機理尚需進一步的研究。

3.3 食源性免疫活性肽參與免疫調節(jié)作用的分子機制

雖然關于食源性活性肽被免疫細胞攝取并參與免疫調控作用的分子機理方面的研究較少，但現(xiàn)有的研究結果大體可歸納為3個方面[32]：

(1) 食源性免疫活性肽直接激活細胞受體(如Toll樣受體，Toll-like receptor，TLR2、3、4、5、6、7、8、9，以及阿片肽受體等)，并刺激如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10等細胞因子的產生，誘導T細胞分化，促進B細胞產生免疫球蛋白(Ig)，并影響巨噬細胞的吞噬作用。

(2) 大豆和乳清的多種具有生物活性的三肽和四肽在進入細胞后，可通過依賴寡肽轉運蛋白(PepT1)行使細胞內抗炎作用。PepT1是一種H+偶聯(lián)的寡肽轉運蛋白，介導腸道上皮細胞吸收多種二肽和三肽，并將肽轉運到血液中。如果抑制PepT1活性，該作用消失，表明通過PepT1轉運對于抗炎作用是必需的。細胞攝取外源寡肽后，這些二肽或三肽通過PepT1的轉運進入胞質溶膠，抑制主要的炎癥信號通路，減少促炎細胞因子(如IL-6、IL-8和TNF-α)的分泌，并降低NF-κB誘導的B細胞、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等的活化。

(3) 分子量大于三肽的食源性免疫活性肽可通過胞吞作用被細胞吸收。胞吞作用的吸收是通過肽和細胞膜之間的疏水相互作用協(xié)助完成的。研究[33]發(fā)現(xiàn)，免疫細胞通過胞吞作用吸收大豆肽lunasin，并在炎癥條件下增加lunasin的攝取量，說明該肽參與抗炎反應。Lunasin是一種43個氨基酸的肽，可與αVβ3整聯(lián)蛋白(Integrin)相互作用，從而抑制αVβ3整聯(lián)蛋白介導的炎癥標記并下調NF-κB途徑。

綜上，食源性免疫活性肽被攝取進入上皮細胞或免疫細胞后，影響免疫信號通路，發(fā)揮免疫調控作用，不同的食源性免疫活性肽參與免疫調控的機制不同[34]。

此外，也有一些食源性免疫活性肽細胞試驗相關的研究報道，包括細胞增殖、吞噬能力及細胞因子的分泌等方面的研究內容。如Li等[35]從環(huán)紋蛤(Cyclinasinensis)蛋白水解產物中篩選出使小鼠巨噬細胞RAW 264.7相對增殖率最高的免疫活性肽SCSP(RVAPEEHPVEGRYLV)，通過細胞試驗發(fā)現(xiàn)，SCSP可通過激活NF-κB信號通路來刺激巨噬細胞活性，增強巨噬細胞吞噬作用，并增加NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β的產生，調節(jié)RAW 264.7細胞中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、核因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB)和NOD樣受體蛋白3(NLRP 3)的蛋白質水平；而NF-κB抑制因子-α(IκB-α)的表達量下調。Wen等[36]對從大米蛋白質胰酶水解產物中分離出的組分RPHs-C-7-3進行免疫活性分析，發(fā)現(xiàn)其可以抑制經(jīng)LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞的炎癥反應；RPHs-C-7-3可抑制NO 和TNF-α的釋放，降低TNF-α、iNOS、IL-6和IL-1的轉錄水平，減弱iNOS和NF-κB的蛋白表達，并阻止p65核轉位的信號通路，對LPS誘導的小鼠巨噬細胞RAW 264.7起抗炎作用。樹突細胞是重要的提呈細胞之一，其中小鼠樹突細胞DC2.4是常用的研究抗原分子參與免疫調節(jié)作用的細胞系，通過考察DC2.4細胞吞噬抗原分子后其標志物CD86與MHC II分子，及細胞因子IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α等的變化分析外源分子所參與的免疫調節(jié)作用[37]。

食源性免疫活性肽對先天免疫和適應性免疫均有調節(jié)作用，包括誘導或調節(jié)細胞因子與免疫球蛋白的產生與分泌，刺激淋巴細胞增殖，增強巨噬細胞的吞噬能力和NK細胞活力，從而提高機體的防御能力，達到抑制促炎反應并抵御病原體入侵的目的；食源性免疫活性肽并不直接與病原體相互作用，而是通過一定的方式進入細胞參與免疫調控作用，提高宿主防御病原體的能力[26]。

4 研究策略及展望

現(xiàn)階段對食源性免疫活性肽作用機理的研究手段可歸納為體外免疫試驗(即細胞模型：如小鼠巨噬細胞RAW 264.7，樹突細胞DC2.4、人單核細胞U937和THP-1等)和體內免疫試驗(動物模型：如小鼠等)兩大類。大多數(shù)細胞試驗中，主要評估在免疫信號轉導中起重要作用的信號分子的變化，如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB及NO等[37]。而動物試驗中，主要考察喂食不同濃度的酶解肽一段時間(如3，7，14，28，45 d)后的動物體重變化，并收集不同組織，如血液、脾臟和胸腺等進行免疫學、血液學和生物化學試驗，主要包括考察淋巴細胞的增殖、腹膜巨噬細胞的吞噬作用、NK細胞的活性、脾臟T淋巴細胞(CD4+和CD8+等)的數(shù)量變化，并檢測分泌免疫球蛋白-A(S-IgA)(黏膜免疫)、血清免疫球蛋白(IgA、IgM和IgG)以及細胞因子(如IL-2、IFN-γ、IL-5和IL-6等)的含量等[28, 37]。

隨著各種組學研究的不斷發(fā)展，蛋白組和轉錄組技術能快速準確篩選差異表達的相關功能蛋白質和基因，研究[38]表明組學技術確實為研究外源肽調控細胞機制的有效手段。如Rojas-Caraballo等[39]采用化學合成含有B-和T-細胞表位的肽，利用該合成肽對小鼠進行免疫處理，并用轉錄組技術對比分析免疫肽保護前后被肝吸蟲損害的脾臟內RNA表達的差異。結果發(fā)現(xiàn)，用含有T細胞表位的3種肽的組合對小鼠有較高的保護作用，生物信息學分析發(fā)現(xiàn)與NO和活性氧產生相關的途徑發(fā)生變化，IL-12 和IL-8信號傳導途徑以及巨噬細胞產生均發(fā)生變化。

目前，對食源性免疫活性肽的探討還處于初級階段，大量存在于食品加工副產物中的蛋白質未被充分利用。以大米為例，中國稻谷每年總產量為2.1億t左右，稻米的加工產生大量碎米、米糠、米渣以及淀粉發(fā)酵的副產物，富含蛋白質，但并未得到充分的開發(fā)利用[40]。因此，有必要進行更加深入的研究，獲得更加有效的分離和篩選策略，并解析食源性免疫活性肽的肽序規(guī)律。在肽組學和免疫信息學的研究基礎上，探索食源性免疫活性肽高效篩選方法，加速食源性免疫活性肽的研究和應用。結合蛋白組學、轉錄組學和生物信息學技術，動態(tài)分析食源性免疫活性肽參與免疫調控的蛋白質和基因表達量變化，并采用組學工具分析這些關鍵基因之間的相互關系，繪制細胞內參與食源性免疫活性肽調控作用的動態(tài)網(wǎng)絡圖。結合動物免疫試驗，檢測相關免疫細胞、細胞因子及免疫球蛋白的變化，最終解析食源性免疫活性肽作用的分子機理。