武嘉庚，楊鳳梅，張 煒，范瑩瑩

0 引言

“潔白”系列品種分為丸劑和膠囊劑2種劑型，皆為生粉入藥，其中水丸規(guī)格為0.8 g/丸，薄膜衣丸規(guī)格為0.8 g/4丸，膠囊劑規(guī)格為0.4 g/粒。潔白膠囊(丸)系治療消化道疾病的經(jīng)典驗方，因其療效確切，應(yīng)用于藏醫(yī)臨床有近千年的歷史，2種劑型處方一致，皆由訶子(煨)、寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等14味中、藏藥材組成。主要功效為健脾和胃，止痛止吐，分清泌濁。用于胸腹脹滿、胃脘疼痛、消化不良、嘔逆泄瀉、小便不利等癥。沉香在方中雖然用量不大，卻是潔白膠囊(丸)中重要的一味藥[1]。

沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材，功能為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘。沉香主治胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急[2-3]。其價格近年來逐步攀升。不少企業(yè)為了追求利潤，不惜以次充好，有意無意使用劣質(zhì)沉香。筆者經(jīng)過前期調(diào)研和考查藏族用藥習(xí)慣，發(fā)現(xiàn)部分藏藥企業(yè)在生產(chǎn)過程中以山沉香代替沉香入藥，鑒于目前約有數(shù)百種中成藥需要沉香進行復(fù)方配伍，這一情況嚴(yán)重影響了成藥的療效[4-7]。

《中國藥典》2015年版一部收載的潔白丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第二十冊)WS3-175(Z-165)-98(Z)和《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn) 第十五冊)WS3-175(X-165)-97(Z)收載的潔白膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均無沉香藥材質(zhì)量控制手段。在前期實驗中，筆者使用HPLC法測定沉香四醇含量時，發(fā)現(xiàn)陰性制劑在沉香四醇色譜峰處有干擾，為了控制潔白膠囊(丸)中沉香質(zhì)量，對廠家的沉香投料情況進行評價，我們建立了UPLC-MS/MS測定潔白膠囊(丸)中沉香四醇的方法，以檢測潔白膠囊(丸)中沉香的使用情況[8]。

1 儀器與材料

THERMO TSQ QUANTUM ULTRA液質(zhì)聯(lián)用儀。電子天平(Sartrious BSA 224S-CW,德國Sartrious公司);超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司);沉香四醇對照品(購自中檢院，批號:16032214，純度99.96%);乙腈為色譜純，水為超純水;其他試劑均為分析純;沉香、山沉香、訶子(煨)、寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等藥材購自亳州康美中藥城，經(jīng)青海省藥品檢驗檢測院楊鳳梅主任鑒定為正品;潔白膠囊(丸)均為市售樣品，涉及4家企業(yè)，共50個批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax Eclipse Pluse C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);以乙腈-0.1%甲酸溶液(75∶25)為流動相;等度洗脫;體積流量：0.3 ml/min;柱溫:40 ℃，進樣量2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI±)，離子源溫度:350 ℃;毛細(xì)管溫度:270 ℃;鞘氣流速:10 L/min;輔助氣流速:5 L/min;毛細(xì)管電壓:3 600 V;透鏡補償電壓 55 V;掃描模式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，具體參數(shù)設(shè)置見表1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取沉香四醇對照品0.013 2 g，置200 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取對照品溶液4 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，按純度99.96%計，每1 ml約含沉香四醇5.28 μg。

2.3.2 供試品溶液的制備 潔白膠囊(丸)供試品溶液的制備方法一致，皆為取潔白膠囊(丸)樣品(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 ml，稱定重量，浸泡0.5 h，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜(0.26 μm)濾過，即得。

2.3.3 陰性及陽性溶液的制備 取按潔白膠囊(丸)的處方比例除去沉香制成陰性樣品，依照“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法，模擬制成沉香陰性對照溶液。取原料藥材，按處方、工藝制得潔白膠囊(丸)陽性樣品，同“2.3.2”項下供試品溶液制備法制成陽性溶液。

2.3.4 山沉香藥材溶液的制備 取山沉香藥材(過三號篩)約2 g，精密稱定，依照“2.3.2”項下供試品溶液的制備方法，制成山沉香藥材溶液。

2.3.5 測定條件 分別精密吸取上述5種溶液各2 μl，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，進行HPLC-MS/MS分析。色譜圖見圖1。由測定結(jié)果得知，沉香對照藥材及陽性樣品溶液分別僅檢測出與沉香四醇對照品保留時間相同的MRM選擇離子峰，子離子豐度比基本一致。山沉香藥材溶液和陰性樣品圖譜中未出現(xiàn)與沉香四醇對照品一致的離子峰，可見陰性在此位置上無干擾。

2.4 沉香四醇方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性 取“2.3.1”項下沉香四醇對照品溶液(5.28 μg/ml)，連續(xù)進樣6次并記錄峰面積。結(jié)果顯示，沉香四醇峰面積RSD為0.25%(n=6)，表明儀器的精密度良好;取“2.3.2”項下供試品溶液(批號:21141)，室溫放置2、3、8、12、18、20 h時進樣并記錄峰面積，結(jié)果顯示，沉香四醇的峰面積RSD為0.65%，表明樣品在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定;取供試品適量(批號:21141)，按“2.3.2”項下方法制備6份平行樣品，分別進樣并記錄峰面積，結(jié)果顯示，沉香四醇峰面積的RSD為0.58%，表明此方法重復(fù)性良好，見表2。

表1 沉香四醇含量測定標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息

圖1 對照品及樣品HPLC-MS/MS 分析圖

2.4.2 加標(biāo)回收率 取已知含量樣品(批號:21141)2 g，共6份，分別加入一定量的沉香四醇對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

2.4.3 線性關(guān)系考察 將沉香四醇用乙醇稀釋制成不同濃度的對照品溶液，進樣測定，記錄峰面積。以沉香四醇質(zhì)量濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y=526.35 X+71.79(r=0.999 8)。結(jié)果表明，沉香四醇檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.52～151 μg/ml。

2.4.4 定量限考察 精密量取“2.3.1”項下對照品，采用逐漸稀釋對照品溶液的方法來確定定量限，結(jié)果表明，沉香四醇的定量限為0.50 ng/ml，證明此方法具有較好的靈敏度。

2.4.5 定量限考察 精密量取“2.3.1”項下對照品，采用逐漸稀釋對照品溶液的方法來確定定量限，結(jié)果表明，沉香四醇的定量限為0.50 ng/ml，證明此方法具有較好的靈敏度，供試品溶液(潔白膠囊，批號:21154)色譜圖見圖2。

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測模式下潔白膠囊(批號:21154)中沉香四醇UPLC-MS/MS色譜圖

2.5 樣品中沉香四醇含量測定 取50批樣品各適量，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量測定(n=50)

3 結(jié)論

沉香作為藥物記載最早見于《名醫(yī)別錄》[9]，并列為上品，其中記載:“沉香、薰陸香、雞舌香、藿香、詹糖香、楓香并微溫。療風(fēng)水毒腫，去惡氣”[10]。《本草綱目》[11]對沉香的功效應(yīng)用也有全面的記載，《中國藥典》2015年版收載的沉香功效為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘，主治胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急，沉香在潔白膠囊(丸)處方中雖然用量不大，卻是重要的一味藥。

潔白膠囊(丸)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中尚無對沉香的檢驗項目，不少企業(yè)以次充好，使用劣質(zhì)沉香或以山沉香代替沉香投料，直接影響了潔白膠囊(丸)的藥效和臨床療效。本實驗通過對不同廠家潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量測定，發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)、相同企業(yè)不同批號間沉香四醇含量差異較大，提示沉香藥材質(zhì)量不穩(wěn)定;某企業(yè)潔白膠囊中沉香四醇的含量相對偏低，提示沉香藥材質(zhì)量較差;三批潔白丸中未檢出沉香四醇，結(jié)合對企業(yè)的前期調(diào)研，提示可能存在用山沉香替代沉香投料的情況。該方法選擇性強，靈敏度高，可用于測定潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量，檢測潔白膠囊(丸)中沉香使用情況，確保潔白膠囊(丸)質(zhì)量可控。