楊芳 楊仕梅 羅雪 吳佳海 宋莉

摘 要：熱激蛋白（HSPs）是細(xì)胞受逆境誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、修復(fù)變性蛋白和維護(hù)生物膜穩(wěn)定等功能的分子伴侶，同時(shí)，在緩解植物高溫傷害和提高熱耐受性等方面有重要的調(diào)控作用。根據(jù)百脈根基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)百脈根Hsp70基因（LjHsp70s）家族的基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、選擇壓力、順式作用元件、表達(dá)特性和系統(tǒng)進(jìn)化等進(jìn)行分析。結(jié)果表明，LjHsp70s家族有18個(gè)成員，分為4類，它們的內(nèi)含子和外顯子數(shù)量為1～8，含有多個(gè)保守基序，分布在6條染色體上，編碼602～703個(gè)氨基酸，均編碼酸性親水蛋白;含有激素、光照及脅迫等響應(yīng)順式作用元件，LjHsp70s在百脈根的根、莖、葉等部位均有表達(dá)，但其表達(dá)量不同;該家族基因在進(jìn)化過程中主要受負(fù)選擇作用，進(jìn)化上較為保守，家族成員與擬南芥和煙草的Hsp70基因可分為6組，但是百脈根LjHsp70s基因僅存在于4個(gè)亞族中，表明其與擬南芥、煙草的Hsp70s基因家族成員之間進(jìn)化關(guān)系密切，同時(shí)也存在一定差異。LjHsp70s基因在百脈根的各個(gè)部位均有表達(dá)，對(duì)百脈根生長(zhǎng)發(fā)育過程起著重要的作用，研究結(jié)果為解析百脈根LjHsp70s基因功能提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百脈根;LiHsp70s基因結(jié)構(gòu);熱激蛋白;生物信息學(xué);功能預(yù)測(cè)

HSPs has important regulatory effects on relieving high temperature damage to plants and improving heat tolerance. Based on the genomic data of the Lotus japonicus，the bioinformatics method were employed to analyze the gene structure，chromosome distribution，selection pressure，cis-acting elements，expression characteristics and phylogenetic evolution of the Hsp70 gene （LjHsp70s） family. The results showed that the LjHsp70s family had 18 members，which were divided into 4 categories. Their introns and exons ranged from 1 to 8. They contained multiple conserved motifs，distributed on 6 chromosomes，encoded 602～703 amino acids，and all encoded acidic hydrophilic proteins. They contained cis-acting elements such as hormones，light and stress，and LjHsp70s were expressed in roots，stems，leaves，and other parts of the roots，but their expression levels were different. This family of genes were mainly negatively selected during evolution process and were conservative in evolution. The Hsp70 genes of the family members and Arabidopsis and tobacco can be divided into 6 groups，but the LjHsp70s gene was only present in 4 subfamilies，it indicated that it had close evolution relationship with the members of the Hsp70s gene family of Arabidopsis thaliana and tobacco，but there were also some differences. The LjHsp70s gene was expressed in all parts of L. japonicus and played an important role in the growth and development of L. japonicus. The results provide a basis for the analysis of the function of LjHsp70s gene.

Keywords：Lotus japonicus; LjHsp70s gene structure; heat shock protein; bioinformatics; function prediction

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞中，在分子進(jìn)化上高度保守，不但參與生物體的正常生理代謝過程，還為高溫等逆境誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生分子伴侶，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、變性蛋白修復(fù)和生物膜穩(wěn)定等起到重要調(diào)節(jié)作用[1]。按分子量大小可將HSPs分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小熱激蛋白五大家族類型。其中，HSP70家族是保守性最高、分布最廣的一類熱激蛋白[2]。

HSPs與逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)，細(xì)胞受環(huán)境脅迫誘導(dǎo)時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生HSPs，其在減輕逆境因子傷害的同時(shí)完成對(duì)植物體的修復(fù)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫、干旱、高鹽、高寒、化學(xué)物質(zhì)和激素等多種環(huán)境因子均能誘導(dǎo)植物Hsp70表達(dá)而增強(qiáng)抗逆性[5];如臘梅CpHsp70-1基因表達(dá)受高溫和低溫誘導(dǎo)，從而增強(qiáng)植株響應(yīng)敏感性[6]。高溫脅迫初期，花楸樹通過SpHsp70-1基因過表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白及膜蛋白的保護(hù)作用，避免高溫脅迫傷害[7]。

百脈根（Lotus japonicus）又名五葉草、牛角花，是世界上廣泛栽培的多年生豆科牧草之一，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、抗旱耐寒、適口性好、采食率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)牧草及水土保持植物。隨著地球“溫室效應(yīng)”的加劇，高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響日益受到重視，Hsp70家族作為抗高溫等逆境脅迫的主要分子伴侶之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗逆境脅迫過程中起著重要的作用，所以對(duì)Hsp70基因功能的研究也越來越受人們的關(guān)注[8]。目前已從芝麻、向日葵、玉米、煙草等植物中鑒定出Hsp70s基因，然而關(guān)于百脈根中LjHsp70基因的信息還未見報(bào)道。本文通過百脈根全基因組序列分析對(duì)LjHsp70s基因家族進(jìn)行鑒定，旨在為進(jìn)一步分析其功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.2 LjHsp70s基因家族成員篩選

利用來自Pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾科夫模型對(duì)百脈根全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，使用Hmmsearch軟件篩選符合模型的所有百脈根蛋白序列。使用 Pfam（http：//pfam.xfam.org/）在線工具（參數(shù)默認(rèn)）除去無LjHsp70典型結(jié)構(gòu)域的序列，篩選百脈根LjHsp70s基因家族蛋白序列。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將檢索得到的百脈根、擬南芥和煙草的Hsp70蛋白序列通過軟件 Clustal X[9]進(jìn)行Hsp70蛋白序列比對(duì)，然后利用MEGA 7.0 [10]軟件構(gòu)建NJ（Neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)置為1000，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)值;使用FigTree（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）軟件展示系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 結(jié)構(gòu)特征和染色體定位分析

利用在線工具GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)LjHsp70s家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，從百脈根數(shù)據(jù)庫獲取LjHsp70s基因在染色體上的位置信息，并用在線工具M(jìn)G2C制作染色體定位圖。

1.5 Hsp70蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析

利用 ExPASy中的ProtParam [11]軟件對(duì)LjHsp70s蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，主要包括蛋白質(zhì)大小、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位等指標(biāo)。利用軟件SOPMA [12]對(duì)LjHsp70s蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.6 基因選擇壓力分析

利用Blast建庫比對(duì)和 KaKs_Calculator[13] 工具，對(duì)百脈根LjHsp70s基因核苷酸的同義替換率（Ks）和非同義替換率（Ka）進(jìn)行計(jì)算，獲得基因Ka/Ks比率，進(jìn)行選擇壓力分析。

1.7 基因順式作用元件分析

利用工具 bedtools[14]獲得LjHsp70s基因上游2000 bp序列，利用在線網(wǎng)站 PlantCARE[15]對(duì)獲得的序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)主要的順式作用元件進(jìn)行探究。

1.8 基因表達(dá)特性分析

為探究LjHsp70s基因在百脈根中的表達(dá)情況，從百脈根芯片數(shù)據(jù)庫下載百脈根在不同組織中基因表達(dá)數(shù)據(jù)，選取花、根、莖等5個(gè)組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用TBtools （https：//www.biorxiv.org/content/early）進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百脈根LjHsp70s基因家族成員與進(jìn)化

利用來自Pfam數(shù)據(jù)庫的隱馬爾科夫模型（登錄號(hào)：PF00012）同百脈根基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)，得到112條序列。根據(jù)Hsp70s家族蛋白分子量范圍為66～78 kDa[16]，去掉不滿足條件的序列，最終篩選得到18條

LjHsp70s家族成員蛋白序列。為進(jìn)一步了解LjHsp70s家族基因的進(jìn)化特性，將百脈根（18條）與模式植物擬南芥（18條）和煙草（60條）的96條Hsp70s蛋白序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表明，96條Hsp70s基因共分為6個(gè)亞族，百脈根LjHsp70s僅存在于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ四個(gè)亞族中，其中，Ⅰ類最多，包含了14個(gè)家族成員，其亞細(xì)胞均定位于細(xì)胞質(zhì)上;Ⅱ類有2個(gè)成員，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體;Ⅲ、Ⅳ類最少，僅各包含了1個(gè)成員，亞細(xì)胞分別定位于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這種分布位置的差異性表明LjHsp70s不同成員之間存在著多樣性。然而，百脈根LjHsp70s家族成員在Ⅳ和Ⅵ類群中的缺失，表明其與擬南芥和煙草Hsp70s基因家族成員在分布和進(jìn)化上存在一定差異，這可能和百脈根屬于豆科植物有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)化枝尖端較短的枝節(jié)表明，聚類的植物Hsp70s家族成員的氨基酸保守性較強(qiáng)，各家族成員間進(jìn)化關(guān)系較密切。在I組進(jìn)化群體中，8條LjHsp70s聚成一個(gè)獨(dú)立的亞群，推測(cè)在豆科植物中，可能會(huì)在I類中形成一個(gè)亞類。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

運(yùn)用在線網(wǎng)站GSDS對(duì)18條LjHsp70s基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，百脈根LjHsp70s基因各成員之間外顯子和內(nèi)含子數(shù)量不同，均分布于1～8之間。在18條LjHsp70s基因家族成員中，LjHsp70-15的內(nèi)含子和外顯子數(shù)目最多，均為8個(gè);數(shù)目最少的是LjHsp70-17，僅有1個(gè)內(nèi)含子和外顯子。此外，LjHsp70-2、LjHsp70-3、LjHsp70-5、LjHsp70-8、LjHsp70-9、LjHsp70-10和LjHsp70-11等7條基因具有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，其中，LjHsp70-1注釋到3和5非翻譯區(qū)（UTR）。

利用MEME在線工具對(duì)LjHsp70s基因家族的蛋白序列進(jìn)行分析（圖3），根據(jù)其保守性的強(qiáng)弱，依次命名為motif1～motif10。除去LjHsp70-11和LjHsp70-18缺失motif9，LjHsp70-16缺失motif5和motif7以外，其他家族成員均分布著10條motif結(jié)構(gòu)，說明它們可能具有相似的功能。

2.3 基因的染色體定位

為充分了解百脈根LjHsp70s基因家族的組成和分布形式，根據(jù)其在染色體上的定位信息，制作染色體分布圖（圖4），以 Chr0 代表對(duì)所有不能定位到染色體的基因所虛構(gòu)的一條染色體[17]。百脈根LjHsp70s基因家族18個(gè)成員分布于6條染色體內(nèi)，在染色體中分布的位置有所不同，大多數(shù)分布于染色體的兩端;其中每條染色體中的LjHsp70s基因個(gè)數(shù)有所差異，1號(hào)染體上分布最多，含有7個(gè)家族成員，并且LjHsp70-5、LjHsp70-6、LjHsp70-7、LjHsp70-8四個(gè)基因以串聯(lián)重復(fù)出現(xiàn);6號(hào)染色體上含有3個(gè)家族成員，4號(hào)染色體上含有2個(gè)家族成員，2號(hào)和3號(hào)染色體上分布最少，僅有1個(gè)基因家族成員，將4個(gè)不能確定位置的成員歸納于Chr0染色體上。

2.4 蛋白的理化特性分析

對(duì)百脈根LjHsp70基因家族蛋白特征進(jìn)行分析（表1），結(jié)果表明LjHsp70編碼蛋白的理化性質(zhì)存在較大差異;在組成蛋白長(zhǎng)度的氨基酸數(shù)量上，最大為703aa（LjHsp70-11），最小為602aa（LjHsp70-17）;蛋白分子質(zhì)量也存在一定的差異，從67.66（LjHsp70-17）～75.93（LjHsp70-7）不等。除了LjHsp70-5、LjHsp70-6.1和LjHsp70-9以外，LjHsp70編碼蛋白的等電點(diǎn)位均小于8，表明大多數(shù)LjHsp70基因家族可能編碼弱酸性蛋白，在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。在18條LjHsp70蛋白中，總平均親水性（GRAVY）均為負(fù)值，表明LjHsp70基因家族編碼蛋白均為親水性蛋白，其中以LjHsp70-15最大，為-0.457;LjHsp70-2最小，為-0.193。不穩(wěn)定指數(shù)介于28.22（LjHsp70-15）～40.82（LjHsp70-16）之間，為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位表明，百脈根Hsp70 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，其家族成員數(shù)量為15 個(gè);另外3 個(gè)成員分別定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、線粒體。

對(duì)LjHsp70s基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明（表2），在18條LjHsp70基因家族成員中，主要包括α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈三種。其中LjHsp70蛋白的α-螺旋和無規(guī)則卷曲比例最高，分別為37.23%～41.96%、37.97%～44.58%;其次是延伸鏈，為15.06%～21.1%。

2.5 選擇壓力分析

利用非同義替換（Ka）和同義替換（Ks）的比值反映選擇壓力是否作用于氨基酸的各位點(diǎn)上。對(duì)來源于LjHsp70s基因家族間親緣關(guān)系最近的6個(gè)基因成員進(jìn)行 Ka/Ks 分析（表3），結(jié)果顯示該基因?qū)χg的 Ka/Ks 比值均小于1，表明百脈根Hsp70s基因家族在進(jìn)化時(shí)主要受負(fù)選擇作用[18]。

2.6 順式作用元件分析

為預(yù)測(cè)百脈根LjHsp70s基因順式作用元件，通過提取基因上游2000 bp序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，百脈根LjHsp70s基因家族除了最基本的CAAT-box外，還包括大量其他順式作用元件，主要包括參與赤霉素反應(yīng)性順式作用元件TATC-box和P-box、低溫響應(yīng)順式作用元件LTR、晝夜節(jié)律調(diào)控順式作用調(diào)控元件circadian、細(xì)胞周期調(diào)控順式作用元件MSA-like、防御和壓力反應(yīng)順式作用元件TC-rich repeats、分生組織表達(dá)順式作用調(diào)控元件CAT-box、胚乳表達(dá)順式調(diào)控元件GCN4_motif、脫落酸反應(yīng)順式作用元件ABRE、生長(zhǎng)素響應(yīng)順式作用元件TGA-element以及光響應(yīng)順式作用元件G-box、AE-box和TCCC-motif等（圖5）。分析表明，百脈根LjHsp70s基因啟動(dòng)子包括大量與激素響應(yīng)、光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，并且這些順式作用元件廣泛參與百脈根的生長(zhǎng)發(fā)育過程，對(duì)植物的生長(zhǎng)起著促進(jìn)和保護(hù)作用。

2.7 表達(dá)特性分析

通過比對(duì)百脈根LjHsp70s基因在不同組織中表達(dá)數(shù)據(jù)，所得結(jié)果表明，百脈根LjHsp70s其因家族成員在根、莖、葉、花、種子五個(gè)組織中具有不同的表達(dá)模式（圖6）。其中，LjHsp70-1、LjHsp70-10、LjHsp70-15和LjHsp70-18在所有被檢測(cè)組織中均有表達(dá)，表明它們?cè)诎倜}根生長(zhǎng)和發(fā)育多個(gè)過程中都起著作用。并且不同基因具有不同的組織表達(dá)特異性，LjHsp70-18在百脈根的花、葉、莖中表達(dá)量較高，而LjHsp70-10在葉、莖、根中表達(dá)量較高，它們?cè)诎倜}根的花、葉、莖以及根的發(fā)育過程中可能起著重要作用。

3 結(jié)論與討論

Hsp70作為逆境脅迫下產(chǎn)生的一類功能型蛋白，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及作為分子伴侶方面起著重要的作用。目前，Hsp70s基因家族在許多植物中均已獲得報(bào)道，如在谷子中發(fā)現(xiàn)有25個(gè)GmHsp70基因[19];野生花生中發(fā)現(xiàn)A. duranensis和A.ipansis分別有 34 、35個(gè)Hsp70基因[20];在玉米中發(fā)現(xiàn)有35個(gè)ZmHsp70基因[21];芝麻中有21個(gè)SiHsp70基因[22]。對(duì)Hsp豆科牧草中70的了解極為有限，導(dǎo)致其對(duì)豆科牧草高溫耐受品種高效應(yīng)用及育種工作的限制，所以，在前人研究的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法從百脈根數(shù)據(jù)庫中鑒定得出18條LjHsp70s基因完整的編碼序列，并且這18條LjHsp70s基因的功能域?yàn)镻F00012.20。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹有助于分析Hsp70s基因在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，本研究以百脈根、擬南芥和煙草共96個(gè)Hsp70s基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，96個(gè)Hsp70s基因家族被分為6個(gè)亞族，但是百脈根LjHsp70s基因僅存在于4個(gè)亞族中，表明其與擬南芥和煙草Hsp70s基因家族成員之間進(jìn)化關(guān)系密切，也存在一定差異。

通過對(duì)百脈根LjHsp70s基因家族進(jìn)行染色體定位分析，18個(gè)成員不均勻的分布在6條染色體上，并且部分基因存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象。趙鵬松等[23]認(rèn)為串聯(lián)重復(fù)在一定程度上可以減輕由染色體突變或是遺傳引起的功能喪失，并且在基因功能的多樣性和特異性中起著作用。Motif結(jié)構(gòu)分析表明，LjHsp70蛋白只有極少數(shù)的成員存在Motif丟失，證明其蛋白高度保守的這一特點(diǎn)。但是Hsp70s基因家族成員存在可變C-末端結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（SBD）和N-末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）。研究發(fā)現(xiàn)，N-末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域可執(zhí)行調(diào)節(jié)功能[24]。C-末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，承擔(dān)了在附著和釋放底物期間發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，而底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域則與在非天然基板中表達(dá)的疏水區(qū)域密切相關(guān)[25]。根據(jù)HSP70蛋白存在的可變結(jié)構(gòu)域推測(cè)百脈根LjHsp70s基因功能可延伸，雖然只分為4個(gè)亞族，但是其通過不同的編輯和結(jié)合方式，同樣可以承擔(dān)更多的功能。對(duì)百脈根LjHsp70蛋白特性進(jìn)行分析，其主要為酸性的親水性蛋白，在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70屬于親水性蛋白質(zhì)，有利于提高植物抵抗非生物脅迫的能力[26]。亞細(xì)胞定位結(jié)果分析，大多數(shù)LjHsp70s基因家族成員分布于細(xì)胞質(zhì)中，其原因可能與它們承擔(dān)的功能相關(guān)，即位于細(xì)胞質(zhì)中的LjHsp70s成員在協(xié)同參與信息傳遞到細(xì)胞核中起著一定的作用，從而調(diào)控基因在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)[27]。在I組進(jìn)化群體中，8條LjHsp70s聚成的獨(dú)立亞群，其亞細(xì)胞均定位于細(xì)胞質(zhì)，推測(cè)這8條基因在百脈根生長(zhǎng)發(fā)育過程中承擔(dān)了協(xié)助蛋白折疊、阻止蛋白聚集、維持細(xì)胞器前體蛋白結(jié)構(gòu)的功能[28]。

對(duì)LjHsp70s基因上游的TC-rich repeats、circadian、ABRE、TATC-box和P-box等多個(gè)順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，百脈根中LjHsp70s基因的表達(dá)可能受到光響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、赤霉素及脫落酸等作用元件的調(diào)控，并且通過這些順式作用元件參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)植物的生長(zhǎng)起著保護(hù)和促進(jìn)作用。例如，脫落酸（ABA）是參與非生物脅迫反應(yīng)的必需植物激素，參與干旱脅迫的代謝調(diào)控[29];研究表明，ABA可通過控制氣孔關(guān)閉和基因表達(dá)調(diào)控通路[31]，通過對(duì)百脈根LjHsp70s家族基因不同時(shí)期組織器官的表達(dá)特性分析結(jié)果表明，有16條LjHsp70s基因在植物體內(nèi)各個(gè)部位以及不同時(shí)期均可以表達(dá)，其表達(dá)具有廣譜性，在一定程度上反映了LjHsp70s基因在百脈根生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要性。

本文通過對(duì)百脈根LjHsp70s基因家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，較為系統(tǒng)地揭示了百脈根LjHsp70s基因的理化性質(zhì)、順式作用元件及進(jìn)化特性，為該基因功能研究及分子調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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