謝偉鴻， 余東升， 趙瑋

中山大學光華口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院廣東省口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東 廣州（510055）

牙齒發(fā)育異常（tooth agenesis）是口腔臨床上最常見的遺傳發(fā)育性疾病，指不同程度的先天性牙齒缺失和/或形態(tài)改變以及萌出異常［1］?；诓煌娜丝诤偷乩矸植?，牙齒發(fā)育異常的患病率為（6.53 ± 3.33）%［2］，先天缺牙對患者的頜面部發(fā)育及美觀和咀嚼功能產(chǎn)生嚴重的影響。根據(jù)有無伴發(fā)全身癥狀，先天缺牙可分為綜合征型先天缺牙與非綜合征型先天缺牙。非綜合征型先天缺牙中，該疾病僅影響牙列，而綜合征型先天缺牙影響著其他器官或組織［3］。

在牙胚發(fā)育的每個階段，上皮細胞和間充質(zhì)細胞二者之間存在復雜的分子網(wǎng)絡，其中的信號分子互相作用，形成反饋信息調(diào)節(jié)環(huán)路，傳遞信息，負責牙齒各個性狀的發(fā)育，調(diào)控牙胚發(fā)育有序精確地進行。與此同時，各種信號分子的表達又受到上皮-間充質(zhì)相互作用的反饋和影響。這一過程嚴密而精確，若出現(xiàn)絲毫干擾或者誤差，都會使先天缺牙或其他疾病的發(fā)生。先天缺牙主要分為散發(fā)病例和家族遺傳病例2 種，相較而言，家族遺傳病例為常染色體顯性遺傳、常染色體隱形遺傳或X 染色體連鎖遺傳。根據(jù)遺傳學和分子生物學研究后發(fā)現(xiàn)，已有多個致病基因被證實與非綜合征型先天缺牙相關(guān)，包括配對盒基因9（paired box gene 9，PAX9）、肌節(jié)同源盒基因 1（muscle segment homeobox 1，MSX1）、軸抑制蛋白基因 2（axis inhibition protein 2，AXIN2）等。其相關(guān)信號通路主要為 Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/βcatenin）信號通路、TGF-β/BMP（transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein）信號通路和EDA /EDAR /NF- κb（ectodysplasin/ectodysplasin A receptor/nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）信號通路。下面將以非綜合征型先天缺牙相關(guān)的基因為基礎對其通路及其分子機制進行闡述。

1 非綜合征型先天缺牙相關(guān)的信號通路

1.1 Wnt/β-catenin 信號通路

在牙齒發(fā)育過程中，Wnt/β-catenin 信號通路作用顯著，該通路組分表達廣泛，活躍于整個牙胚發(fā)育過程中，β-catenin 的退化和 AXIN2、WNT10B 等基因的抑制均可引起缺牙、過小牙等牙胚發(fā)育中的各種異常［4］。Wnt/β-catenin 信號通路的機制包括胞外分泌糖蛋白，如Frizzled 家族蛋白、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5/6（low-density lipoprotein receptorrelated protein 5/6，LRP-5/6）；七次跨膜蛋白受體（dishevelled，Dsh/Dvl）；腺瘤息肉病大腸桿菌（adenomatosis polyposis coli protein，APC）；中軸抑制蛋白（axis inhibition protein，AXIN）；糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）；β -catenin；核轉(zhuǎn)錄因子，如 T 細胞因子（T-cell factor，TCF）、淋巴增強因子（lymphoid enhancer-binding factor，LEF）和幾種Wnt 相關(guān)分子。牙胚發(fā)育初期階段時，LEF1 和β-catenin 等信號分子敲除或受到抑制，將會阻礙牙胚發(fā)育，導致其長期處在蕾狀期或［5-6］。自首次報道了在先天缺牙家系中發(fā)現(xiàn)AXIN2 基因的移碼突變后，Bergendal 等［7］、Yue 等［8］先后報道了AXIN2 基因突變可導致在綜合征和非綜合征型先天缺牙。在牙齒形成過程中，AXIN2 在牙釉質(zhì)結(jié)和間充質(zhì)成牙本質(zhì)細胞中高度表達，其編碼蛋白為Wnt/β-catenin 信號通路的細胞內(nèi)抑制劑。AXIN2 的錯義突變可促進β-catenin 的降解和降低Wnt 的活化，而其截短突變則可增強Wnt/βcatenin 的活化［8］。

有報道發(fā)現(xiàn)在牙-甲-皮膚發(fā)育不良綜合征患者存在 WNT10A 基因突變，Zeng 等［9］、Song 等［1］也先后報道WNT10A 的突變可引起綜合征型和非綜合征型先天缺牙。WNT10A 定位于染色體2q35上，在牙齒發(fā)育過程中在牙本質(zhì)和釉質(zhì)結(jié)節(jié)中優(yōu)先表達。另外，WNT10B 也被證實是先天缺牙相關(guān)的致病基因。Yu 等［10］報道了在中國人群中發(fā)現(xiàn)的4 個WNT10B 基因突變可以導致非綜合征型先天缺牙的發(fā)生，在小鼠牙齒發(fā)育過程中，WNT10B 于蕾狀期和帽狀期在牙上皮中表達。

LRP6 編碼 Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)的共受體復合物的關(guān)鍵成分，用于細胞分化和增殖。在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)染的LRP6 突變體由于糖基化異常和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未成熟的高甘露糖形式而未能激活β-catenin，從而導致 Wnt 信號通路激活失敗［11］。LRP6 也被認為是人類牙髓干細胞血管生成分化的必需成分。

在發(fā)育過程中，β-catenin 不僅關(guān)系到Wnt 信號，也關(guān)乎細胞間的附著。在細胞質(zhì)內(nèi)部，βcatenin 與由APC、AXIN、GSK3β 和酪蛋白激酶Ⅰ組成的蛋白復合體在無Wnt 受體影響下有著一定程度的相互作用。由于受到GSK3β 和酪蛋白激酶Ⅰ連續(xù)的磷酸化雙重作用影響，β-catenin 泛素化，并且伴隨著退化出現(xiàn)，影響著Wnt 靶基因轉(zhuǎn)錄，甚至直接導致轉(zhuǎn)錄失敗。但是，如果在配體中搭載一個Wnt 受體時，其將和LRP-5/6 共同受體，并對細胞內(nèi)散亂蛋白質(zhì)激活，達到干擾或破壞細胞質(zhì)中βcatenin 穩(wěn)定性作用。在此情況下，β-catenin 處于不斷積累的過程并逐漸進入細胞核中，最終對Wnt 靶基因的轉(zhuǎn)錄起到激活作用［4］。

1.2 TGF-β/BMP 信號通路

TGF-β/BMP 信號通路在胚胎發(fā)育中起著重要的作用。在顱面發(fā)育中，骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）以一種階段依賴的反復的方式誘發(fā)上皮和間充質(zhì)之間的交互作用，并在釉結(jié)中表達。BMP2、BMP4 和BMP7 在牙源性上皮中均有表達，BMP2和BMP4的重組體可被用作誘導間充質(zhì)分化的牙源性上皮的替代品。BMP4 信號在牙齒發(fā)育中所起的作用最為突出，是傳導上皮-間充質(zhì)之間信號的候選分子。GREM2（Gremlin2）基因編碼BMP4 的拮抗蛋白，參與TGF-β 信號轉(zhuǎn)導在牙齒發(fā)育中的調(diào)控。迄今為止發(fā)現(xiàn)的GREM2 中的三個突變（OMIM：608832）與先天缺牙、過小牙、短根牙和長冠牙有關(guān)［12］。轉(zhuǎn)化生長因子β 結(jié)合蛋白3（latent-transforming growth factor beta-binding protein 3，LTBP3）基因編碼與TGF-β形成復合物的配體，參與TGF-β 分子的組裝、分泌和靶向。LTBP3 的突變可導致遺傳性牙齒異常和形態(tài)過小。在10 個不同突變的報導中，有2 例發(fā)現(xiàn)可導致孤立的少牙。實驗中，Ltbp3-/-小鼠表現(xiàn)出異常的牙釉質(zhì)和牙根形態(tài)［13］。

1.3 PAX9 基因和 MSX1 基因

研究表明牙先天缺失和PAX9、MSX1 基因密切相關(guān)，兩者是最早發(fā)現(xiàn)的單純型先天缺牙的相關(guān)基因。PAX9 作為PAX 家族新發(fā)現(xiàn)的重要組成部分，主要在上下頜神經(jīng)嵴來源間質(zhì)表達，直接影響著牙齒和上顎發(fā)育，此外，PAX9 也被認為是脊椎動物中牙齒發(fā)育不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，在牙齒發(fā)育最初階段，被認為是早期分子標志。人類PAX9 所處位置位于14q12-q13，主要構(gòu)成元素有4個外顯子，編碼341 個氨基酸和 2、3、4 為編碼區(qū)。其中，DNA 結(jié)合域（第4-131 位氨基酸）核苷酸是PAX9 重要的功能域，也是此基因的突變熱點。自發(fā)現(xiàn)以來，共計有三十個左右的PAX9 突變位點和先天缺牙有密切關(guān)聯(lián)，包括多種突變類型，且多集中在DNA 結(jié)合域。

MSX1 屬于同源異形盒中的MSH 家族，是重要的轉(zhuǎn)錄因子，位于4 號染色體短臂4p16.3-p16.1，包含著一個高度保守的編碼60 個氨基酸長度，并且還擁有DNA 結(jié)合能力的同源異型結(jié)構(gòu)域的同源異型框序列。MSX1 包含2 個外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)為在胚胎發(fā)育過程多種組織中均有表達的轉(zhuǎn)錄因子。有報道在先天缺牙的散發(fā)病例和家系中發(fā)現(xiàn)MSX1 基因的大片段缺失、外顯子1 插入一個堿基導致的移碼突變和剪切突變等［14-16］，在已確認的20 余種MSX1 致病突變中，雜合錯義突變占大部分，且主要集中在2 號外顯子編碼區(qū)［17］。與PAX9受累牙位不同，MSX1 突變主要影響上頜第二前磨牙，而后為下頜第二前磨牙、第三磨牙、上頜第一前磨牙和下頜第一磨牙。且MSX1 基因突變所致先天缺牙易伴發(fā)唇腭裂/口面裂、牙-甲-皮膚發(fā)育不良綜合征和Wolf-Hirschhorn 綜合征［18］。

PAX9 基因和MSX1 基因?qū)е孪忍煅廊笔е饕ㄟ^對上皮細胞和間充質(zhì)細胞相互作用和牙胚相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響。在牙齒發(fā)育中，MSX1 和PAX9 編碼的轉(zhuǎn)錄因子緊密聯(lián)系在一起，它們通過上皮細胞和間充質(zhì)細胞相互作用而相互影響，保證BMP4 在間充質(zhì)中的表達，與此同時，BMP4 主要起作用階段是牙胚變化階段，尤其是從蕾狀期過渡到帽狀期階段。Gerits 等［19］研究表明，在人體中，PAX9 和MSX1 突變出現(xiàn)以后，可以讓自身編碼蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在影響其熱穩(wěn)定性、三維折疊基礎上，對編碼蛋白功能進行影響，還阻礙其DNA 結(jié)合能力且影響各個部分轉(zhuǎn)錄因子之間所發(fā)生作用，最終影響到牙齒發(fā)生發(fā)展。

1.4 EDA/EDAR/NF-κb 信號通路

EDA/EDAR/NF-κb 信號通路在牙齒發(fā)育過程中起到了重要的作用，其中的外異蛋白（ectodysplasin，EDA）基因、少汗型外胚層發(fā)育不良相關(guān)蛋白（ectodysplasin A receptor associated adapter protein，EDARADD）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factors 6，TRAF6）和 IKBKG（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，kinase gamma，IKBKG）基因的突變在牙齒發(fā)育相關(guān)研究中都已有報道。

EDA 基因集中分布在染色體Xq12～13.1 上，突變發(fā)生可能性很高，因此一般都會發(fā)生來至于外胚層發(fā)育器官，主要體現(xiàn)為皮膚、牙齒等的發(fā)育異常［20］。Srivastava 等［21］通過定位克隆的方法發(fā)現(xiàn)EDA 基因的第1 和第2 外顯子，并在少汗性外胚葉發(fā)育不全（hypohidrotic ectodermal dysplasia，HED）患者中發(fā)現(xiàn)該基因的突變。Bergendal 等［5］、Cluzeau 等［22］則報道了在先天缺牙患者中發(fā)現(xiàn)EDARADD、TRAF6、IKBKG 的突變。目前，EDA 基因其突變檢出率約占HED 患者的63%-95%，是HED 的主要致病基因［23-30］。Wang 等［31］報道，EDA基因突變導致HED 可能與其啟動子的甲基化狀態(tài)有關(guān)。特定胚胎發(fā)育基因表達和細胞分化受到DNA 甲基化影響很大。組蛋白脫甲基酶出現(xiàn)以后，可以對牙干細胞分化起到控制作用。牙礦化的整個反應過程中，牙本質(zhì)涎磷蛋白和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 基因在牙囊細胞中的表達有時候會受到組蛋白H3 第27 位賴氨酸上的三甲基化影響，甚至是直接被抑制。此外，賴氨酸脫甲基酶6B（lysine demethylase 6B，KDM6B）一個重要作用就是可以加快牙間充質(zhì)干細胞的牙源性分化。

2 非綜合征型先天缺牙相關(guān)信號通路網(wǎng)絡之間的聯(lián)系

牙齒形態(tài)發(fā)生是一個復雜的發(fā)育信號網(wǎng)絡，主要包括 Wnt、TGFβ/BMP 和 EDA/EDAR/NFκB 途徑。大量研究揭示了這些途徑之間的交聯(lián)循環(huán)，它們相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控牙齒發(fā)育過程。研究表明，PAX9 能誘導激活 Wnt/β-catenin 和 TGF-β/BMP信號通路對器官形成的影響［33］。反之，PAX9 的缺乏將導致Wnt/β-catenin 在體內(nèi)的活化降低，而小分子Wnt 激動劑能減輕PAX9 基因敲除小鼠的顱面缺損［34］。不僅如此，在 Pax9-/-的小鼠中，EdAR 的表達水平也顯著降低，提示PAX9與EDA/EDAR/NF-κB 信號通路潛在的相互作用。作為Wnt/β-catenin的直接靶點，MSX1 的表達增加將上調(diào)BMP4 的表達，并激活 TGF-β/BMP 信號轉(zhuǎn)導促進牙發(fā)生［34］。此外，MSX1 可以與PAX9 相互作用，以協(xié)同增強其自身和BMP4表達。Wnt/β-catenin 和TGF-β/BMP 信號通路在牙齒發(fā)育過程中的共表達也表明了它們存在相互調(diào)控的關(guān)系。Wnt/β-catenin能夠通過誘導EDA 的表達從而激活 EDA/EDAR/NF-κb 信號通路，而這一過程又使Wnt/β-catenin活性得以維持。

研究非綜合征型先天缺牙的致病基因和分子機制，一方面有助于了解人類研究牙齒發(fā)育等課題，另一方面有助于從源頭上減少口腔常見病的發(fā)生和發(fā)展。非綜合征型先天缺牙致病基因和分子機制深入、精準的探索甚少，研究透徹仍需口腔基礎醫(yī)學、遺傳學、分子生物學、基因組學、循證醫(yī)學等多領(lǐng)域共同協(xié)作完成。